滇藏杜英总酚提取方法的筛选

田素梅，李兆云，马艳粉

德宏师范高等专科学校（芒市 678400）

酚类化合物广泛存在于植物果实中，是植物次生代谢产物，具有抗氧化、杀菌、清除自由基、消炎多种生物活性，在预防心脑血管、癌症以及衰老方面有着十分重要的作用[1-2]，因此受到广泛的关注。滇藏杜英（Elaeocarpus braceanus）为杜英科杜英树植物，是高5～15 m的乔木，在我国主要分布在云南和西藏[3]。其果实是云南当地人民喜欢的一种野生果品，具有生津止渴和清热解毒的功效[4]。已有的研究表明滇藏杜英果实糖含量中等或偏低，脂肪和蛋白质含量高，维生素C和B2含量较丰富，另外还含有较多的其他化合物，是一种有开发利用价值的野生果品[4-6]。目前，对滇藏杜英总酚的研究尚未见报道，研究拟应用三种方法对滇藏杜英的总酚进行提取，以期探索出较好的提取方法，旨在为其总酚提取提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料与主要试剂

1.1.1 试验原料

市售滇藏杜英来源于云南省傣族景颇族自治州陇川县及周边。

1.1.2 主要试剂

没食子酸标准品（北京索莱宝科技有限公司）；无水乙醇（成都市科隆化学品有限公司）；福林酚（北京索莱宝科技有限公司）；无水碳酸钠（广东省化学试剂工程技术研究开发中心）；以上试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

JA2003电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；SB-5200超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；722S可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；分样筛（0.425 mm，浙江省上虞市道墟化验仪器设备厂）；微孔滤膜（海盐新东方塑化科技有限公司）；XY-350高速多功能粉碎机（浙江省永康市松青五金厂）；SMART-N超纯水机（上海市力康生物医疗科技控股有限公司）；202-1电热恒温干燥箱（上海市崇明实验仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理

将采集到的滇藏杜英清洗干净，自然通风晒干，然后用高速多功能粉碎机将滇藏杜英粉碎成末，过0.425 mm筛子，滤渣再粉碎过筛，收集粉末置于室温下密封保存备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

准确称取0.010 0 g没食子酸标准品，加双蒸水定容至100 mL，即得没食子酸标准品溶液（每毫升含无水没食子酸100 μg）。分别吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL上述标准品溶液于25 mL刻度管内，每个试管内分别加入0.5 mL的福林试剂，摇匀，反应3～8 min后加入4.00 mL 7.5%碳酸钠，用双蒸馏水定容至刻度线，摇匀。室温放置60 min，在波长765 nm条件下测定吸光度，重复3次，取其平均值，以吸光度为纵坐标（Y），标准品没食子酸的质量为横坐标（X），绘制标准曲线。

1.3.3 试验方案设计

1.3.3.1 乙醇浸渍法

已有的研究表明料液比，乙醇体积分数，提取次数是影响总酚提取的三个重要因素[7-8]。前期已进行单因素试验，结果发现料液比在1∶30～1∶50（g/mL）总酚提取率较高，乙醇体积分数在60%～80%范围内总酚提取率较高，提取次数1～3次总酚提取率较高。在此基础上以总酚提取量作为评价指标，采用L9(34)正交表，进行正交试验，各因素水平设计方法见表1。

表1 乙醇浸渍法正交试验因素水平表

准确称取1 g粉碎后的滇藏杜英，分别放入250 mL烧杯内，按照不同料液比加入不同体积分数乙醇溶液，提取不同次数，静置提取完成后过滤浓缩，滤液定容到100 mL，于4 ℃密封、避光保存备用。分别用移液管移取1 mL各待测提取液于25 mL刻度管内，按照1.3.2小节方法进行测定，并根据标准曲线计算出各组待测试样中总黄酮总酚含量，再根据式（1）计算出样品中总酚含量（%）。

式中：m1为依据标准曲线计算出被测液中总酚含量，μg；m为供试品取样量，g；V1为待测液分取的体积，mL；V2为待测液的总体积，mL；100为单位换算系数。

1.3.3.2 回流提取法

根据已有的研究将料液比、提取时间、提取温度设为回流提取法提取总酚的三个重要影响因素[9]。前期单因素试验表明料液比范围在1∶30～1∶50（g/mL）总酚提取率较高，回流1～2 h总酚提取率较高，提取温度为90～100 ℃提取率较高。在此基础上采用L9(34)正交表，进行正交试验，各因素水平设计方法见表2。

表2 回流提取法正交试验因素水平表

称取保存备用的滇藏杜英粉末各1 g，分别放入250 mL圆底烧瓶内，加入95%乙醇溶液，放在水浴锅装置上，提取完成后过滤浓缩，滤液定容到100 mL，于4 ℃密封、避光保存备用。分光光度计测定方法同上。

1.3.3.3 超声波提取法

根据试验前期已做的单因素试验，单因素试验表明料液比范围在1∶20～1∶40（g/mL）总酚提取率较高，超声提取温度20～40 ℃总酚提取率较高，提取次数1～3次提取率较高。故此次试验选用提取温度、料液比及提取时间作为试验因素，每个因素设三个水平，采用L9(34)正交表，进行正交试验，各因素水平设计方法见表3。

表3 超声波提取法正交试验因素水平表

称取保存备用的滇藏杜英粉末各1 g，分别放入250 mL锥形瓶内，加入95%乙醇溶液，放入超声波清洗装置中，设置参数：电流1.0 A、频率40 kHz、提取完成后过滤浓缩，滤液定容到100 mL，于4 ℃密封、避光保存备用。分光光度计测定方法同上。

1.4 数据处理与分析

采用 Excel进行数据整理及制表绘图，采用IBM SPSS 24法进行方差分析与多重比较。利用模糊数学中的模糊隶属函数法对三种提取方法总酚提取率进行模糊综合评价，筛选出提取率最佳的方法。隶属函数的计算公式见式（2）和（3）。

式中：Xij为第i种提取方法的第j个处理的总酚提取率；Xjmax和Xjmin分别为所有处理总酚提取率的最大值和最小值；n为每种提取方法的处理总数；U为每提取方法n个处理的隶属度平均值。隶属度平均值越大，表示该提取方法效果越好。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

以吸光度为横坐标，没食子酸质量为纵坐标，绘制标准曲线（图1）。 所得标准曲线的线性回归方程为y=2.989x+0.049（R2=0.994）。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 正交试验结果直观分析

对乙醇浸渍法正交试验的结果进行直观分析，结果如表4所示。由极差值（R）可知，提取次数（C）对滇藏杜英总酚的提取影响最大，其次是乙醇体积分数（B）。提取次数（C）极差值（R）是乙醇体积分数（B）的1.7倍，料液比（A）的3.6倍。在提取次数（C）中，提取3次时提取率的因子总和或平均值最高。分析乙醇体积分数时，使用80%的乙醇体积分数时因子总和或平均值最高。料液比（A）对提取率也有一定影响，当料液比为1∶30（g/mL）时，因子总和或平均值提取率最高。综合以上直观分析分析结果，滇藏杜英总酚提取的最优组合为A1B3C3，即以1∶30（g/mL）的料液比，80%的乙醇，在室温条件下，提取次数3次。根据因素主次顺序排列，结果为C3B3A1。

表4 乙醇浸渍法提取滇藏杜英总酚正交试验结果

根据回流提取法正交试验直观分析结果（表5）可知，料液比（A）、提取温度（B）和提取时间（C）的极差值（R）分别为19.04，11.94和17.17。说明在回流提取法中各因素对滇藏杜英总酚的提取率都有较大影响，其中料液比（A）影响最大，其次是提取时间（C），与前二者相比提取温度（B）影响略低。对试验各因素每个水平的因子总和或平均值进行比较可知，料液比为1∶50（g/mL）时，该水平总酚提取率的因子总和或平均值最高，在100 ℃条件下因子总和或平均值最高，当提取时间2 h时因子总和或平均值最高。因此，回流提取法提取滇藏杜英总酚提取的最优组合为A3B3C3。根据因素主次顺序排列，结果为A3C3B3。

表5 回流提取法提取滇藏杜英总酚正交试验设计与结果

利用超声波提取法提取滇藏杜英总酚，根据正交试验结果的直观分析（表5）可知，提取温度（B）的极差（R）最大，其次是料液比（A），提取次数（C）的极差（R）最小。由此可知，在考察的3个影响因素中，影响滇藏杜英总酚提取的因素主次顺序依次为提取温度＞料液比＞提取次数。提取温度为70℃时，因子总和或平均值最高，料液比为1∶20（g/mL）时因子总和或平均值最高，提取次数为1次时因子总和或平均值最高。综上所述利用超声波提取法提取滇藏杜英总酚提取的最优组合为A1B3C1。根据因素主次顺序排列，结果为B3A1C1。

表6 超声波提取法提取滇藏杜英总酚正交试验设计与结果

2.3 正交试验结果方差分析

对正交试验结果进行方差分能够精确地检验出各因素对试验结果影响的显著性, 并能估计试验误差。运用乙醇浸渍法提取滇藏杜英总酚时，由表7可知，提取次数对滇藏杜英总酚提取率的影响达到显著水平（P＜0.05），其他两个因素对滇藏杜英总酚提取率的影响未达到显著水平（P＞0.05）。只进行1次提取时，乙醇浸渍法提取的提取率显著低于（P＜0.05）2次和3次提取的提取率（图2a）。虽然3次提取的提取率高于2次提取的提取率，但二者并无显著差异。回流提取法正交试验结果方差分析（表7）显示，所选取的料液比、时间、温度三个因素滇藏杜英总酚提取率的影响并不显著（P＞0.05），同一因素个水平间亦无显著差异（P＞0.05）（图2b）。在超声波提取法中，料液比、温度和提取次数对总酚提取率均有显著的影响（P＜0.05），其中料液比和温度的影响达到了极显著水平（P＜0.01）（表7）。当料液比为1∶20和1∶30（g/mL）时总酚提取率极显著（P＜0.01）地高于1∶40（g/mL）的料液比（图2c），1∶20和1∶30（g/mL）之间无显著差异；提取温度为40 ℃时，提取率最高（P＜0.01）；提取次数为1次时效果最佳。根据方差分析结果可知超声波提取法的最佳方案为A1B3C1，按显著性进行排序为B3A1C1。

图2 各种提取方法中同一因素不同水平提取率差异比较

表7 不同方法提取滇藏杜英总酚提取率正交试验方差分析表

2.4 各提取方法提取滇藏杜英总酚提取率比较和综合评价

对不同提取方法提取滇藏杜英总酚的提取率进行比较（图3），运用回流提取法的提取率显著高于乙醇浸渍提取法和超声波提取法（P＜0.05）。虽然超声波提取法的提取率稍高于乙醇提取法，但二者并无显著差异（P＞0.05）。从模糊隶属函数对不同提取方法提取滇藏杜英总酚的综合评价（图4）可以看出：回流提取法的平均隶属值最高（0.620）；其次乙醇浸渍法，平均隶属值为（0.225）；超声波提取法的平均隶属值最低（0.035）。

图3 不同提取方法提取率比较

图4 不同提取方法平均隶属值

3 讨论

酚类是植物体内的次生代谢产物，对其进行提取时，影响其提取率的工艺参数因物种的不同而不同，目前国内使用较为广泛的一类多酚提取方法是溶剂萃取法[10]。由于受多酚来源不同的影响，影响多酚提取率工艺参数也不同，通常浸提条件、浸提剂、浸提时间、温度、次数等都会对提取率产生不同的影响[10-11]。研究结果显示，提取次数对乙醇浸渍法提取滇藏杜英总酚有显著影响，且提取1次的提取率显著低于多次提取的提取率，但当提取次数超过两次时提取率差异并不显著，因此从节省人力物力和提高效率角度考虑，运用乙醇浸渍法提取滇藏杜英总酚时，选择提取次数2次为最佳。料液比和乙醇体积分数对乙醇浸渍法提取滇藏杜英总酚的影响在统计学上虽达不到显著水平，但运用直观分析法可知，当料液比和乙醇体积分数分别为1∶30（g/mL）和80%时提取效果最佳。因此结合直观分析法结果乙醇浸渍法提取滇藏杜英总酚的最佳方案为C2B3A1。

回流提取法是一种重要的植物总酚提取方法。在提取滇藏杜英总酚时，回流提取法的总酚提取率均显著高于乙醇浸渍法和超声波提取法，另外回流提取法平均隶属值最高，表明三种提取滇藏杜英总酚的方法中回流提取法的提取率最高。各因素影响提取率的方差分析中，回流提取法的三种因素对提取率的影响均不显著，且误差值较高，这说明还有其他重要的因素影响滇藏杜英总酚的提取率。因此运用回流提取法提取滇藏杜英总酚时还需要进一步探索其他因素对总酚提取率的影响。回流提取法的三种因素对提取率的影响均不显著，但通过直观分析可知试验三种因素的最优组合为A3C3B3。

超声波提取法是利用超声波产生的各种效应，如强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，破坏多酚类化合物内的氢键和疏水键而加速有效成分进入溶剂，以达到避免高温对提出成分的影响，从而提高提取率、缩短提取时间[12-13]。在利用超声波提取法提取滇藏杜英总酚时，料液比、温度和提取次数对提取率的影响均达到显著水平，由此可见在利用该方法提取滇藏杜英总酚时应当重点考虑和控制这三个因素。综合直观分析和方差分析的结果，最优组合为B3A1C1。对各提取方法提取滇藏杜英总酚提取率比较和综合评价结果发现，超声波提取法提取率最低。在使用该方法提取滇藏杜英总酚时还需进一步改进，探索出提取率更高的方案。

4 结论

通过试验研究，运用乙醇浸渍法提取滇藏杜英总酚时，应采用C2B3A1方案，即乙醇体积分数为80%，提取次数为3次，料液比为1∶30（g/mL），此时总酚提取率最高。采用回流提取法提取时，采用料液比1∶50（g/mL）、提取温度100 ℃、提取时间2 h的组合提取效率最高（A3C3B3）。利用超声波提取法提取滇藏杜英总酚时，应将提取温度设为30 ℃，料液比设为1∶20（g/mL），提取次数设为1次 （B3A1C1），这样提取效率最高。采用回流提取法提取滇藏杜英总酚可实现较高的提取率。