表面活性剂协同超声提取香菇多糖

张琴，康明丽*，赵茹，张扬，朱志强, ，周永斌, *

1. 河北科技大学食品与生物学院（石家庄 050000）；2. 国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津），农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室（天津 300384）；3. 天津市农业科学院农产品保鲜与加工技术研究所（天津 300384）

我国食用菌产量位居世界第一，其中香菇产量2020年达1 188万 t，占食用菌总产量29.3%[1]。香菇（Lentinus edodes）是药食两用真菌[2]，属担子菌纲、口蘑科、伞菌目的香菇属，营养丰富，味道鲜美，被视为“菇中之王”[3]。香菇多糖（Lentinan，LNT）是从香菇中提取的天然活性物质，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等活性，在药物研发行业有着较大的发展潜力，是目前的研究热点[4-6]。

香菇多糖的提取工艺主要有热水浸提法、酸浸提法、低温气流破壁法、微生物发酵提取法和酶提取法[7-10]，这些方法存在耗时长、提取效率不高或能耗较高等不足。超声波辅助提取法相对于传统的方法，操作更加简单快捷，提高了提取效率，节约了大量的时间，其工艺成本也相对较低[11-13]。表面活性剂是近年来发展起来的一种提取方法，可以降低溶剂与物料之间的界面张力，使得物料更易浸润，溶剂也易于渗透植物细胞中，增强物质的溶解性[14-15]。利用表面活性剂协同超声提取香菇多糖的研究较少，表面活性剂协同超声提取香菇多糖，能更大程度上使多糖析出，提高提取效率。试验以香菇为原材料，进行了表面活性剂的筛选，并采用表面活性剂协同超声辅助提取技术对多糖进行提取，为香菇多糖提取提供实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香菇：河北省涞水县香菇基地，挑选形状大小基本一致、无病虫害的香菇子实体，使用恒温鼓风干燥箱将样品烘干至质量差低于0.01 g，经FW100型高速万能粉碎机粉碎得粉末，过0.250 mm筛，备用。

吐温-80（分析纯，天津市光复精细化工厂）；十二烷基硫酸钠（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；聚乙二醇-400、酒石酸钾钠（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；蔗糖酯（分析纯，北京迪朗生化科技有限公司）；3, 5-二硝基水杨酸（分析纯，津东天正精细化学试剂厂）；盐酸（分析纯，烟台市双双化工有限公司）；无水亚硫酸钠（分析纯，天津市红岩化学试剂厂）；亚铁氰化钾（分析纯，天津欧博凯化工有限公司）；乙酸锌（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）。

UV-5100B紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥机（上海精宏试验设备有限公司）；SB-5200DT超声清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；FA1204B型分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 香菇多糖提取工艺

参考王莉丽等[16]的方法稍作修改。准确称取2.0 g香菇粉末样品置于250 mL锥形瓶中，按照一定的料液比加入含有表面活性剂的去离子水，在室温下超声处理提取一段时间后，离心10 min，吸取15 mL上清液，加入3 mL乙酸锌溶液和3 mL亚铁氰化钾溶液，在容量瓶中定容至50 mL，离心取上清液，得多糖提取液。

1.2.2 单因素试验设计

1.2.2.1 不同表面活性剂种类对多糖含量的影响

以多糖含量为指标，固定超声处理时间40 min、料液比1∶30（g/mL）、表面活性剂添加量2%，考察不同类型表面活性剂（聚乙二醇-400、十二烷基硫酸钠、吐温-80、蔗糖酯）对多糖含量的影响。

1.2.2.2 不同表面活性剂用量对多糖含量的影响

以多糖含量为指标，按1.3.2.1小节选择表面活性剂种类聚乙二醇-400，固定超声处理时间40 min和料液比1∶20（g/mL），考察不同表面活性剂用量（1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%）对多糖含量的影响。

1.2.2.3 不同料液比对多糖含量的影响

以多糖含量为指标，按以上小节确定表面活性剂种类聚乙二醇-400，聚乙二醇-400添加量为2%，固定超声处理时间40 min，考察不同料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）对多糖含量的影响。

1.2.2.4 不同超声处理时间对多糖含量的影响

以多糖含量为指标，按以上小节确定的最佳条件聚乙二醇-400、料液比1∶20（g/mL）、聚乙二醇-400添加量2.0%，考察不同超声处理时间（20，30，40，50和60 min）对多糖含量的影响。

1.2.3 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，以多糖含量为响应值，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，设计三因素三水平响应面试验，响应面分析因素与水平见表1，并进行方程拟合最适条件的验证。

表1 响应面分析因素水平

1.2.4 多糖含量的计算

1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的制作

按照葡萄糖标准曲线的制作方法[17]，用移液枪精精移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL 1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液，各自置于10 mL比色皿中，分别补水至2.0 mL，以纯水为对照，依次加入2.0 mL的DNS，沸水浴5 min，冷却，摇匀，设置波长540 nm，测定吸光度。以葡萄糖质量（mg）为横坐标，相对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程y=1.437 6x-0.065 2（R2=0.997 1）。

1.2.4.2 多糖含量的测定及含量的计算

采用3, 5-二硝基水杨酸法测定多糖含量[18-19]，按式（1）计算香菇多糖的含量。

式中：X为多糖含量，%；M为香菇称样量，g；m2为样品溶液的吸光度对应标准曲线，查得的多糖质量，mg；v1为提取体积，mL；v2为分取体积，mL；v3为最后定容体积，mL；v4为用于比色的样液体积，mL；100为换算为百分含量的系数；1 000为将g换算成mg的系数。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0、Origin 8.0和Design Expert 11处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同表面活性剂种类对香菇多糖含量的影响

如图1所示，在其他条件相同的情况下，处理组比空白组的多糖含量高，说明表面活性剂协同超声提取香菇多糖的效果明显，多糖含量由大到小排列：聚乙二醇-400＞十二烷基硫酸钠＞蔗糖酯＞吐温-80＞空白。其中聚乙二醇-400的提取效果最好，多糖含量为6.42%。因此，在后续采用聚乙二醇-400协同超声提取香菇多糖。

图1 表面活性剂种类对多糖含量的影响

2.1.2 不同表面活性剂添加量对香菇多糖含量的影响

如图2所示，表面活性剂添加量在1%～2%时香菇多糖含量表现出上升趋势，当添加量为2.0%时，多糖含量达到最大值5.58%，当添加量超过2.0%后，多糖含量降低，因此，聚乙二醇-400提取香菇多糖的最佳添加量为2.0%。

图2 表面活性剂添加量对多糖含量的影响

2.1.3 不同料液比对香菇多糖含量的影响

由图3可知，多糖含量随着料液比中液体占比的增加而呈现上升趋势，当料液比为1∶20（g/mL）时，香菇多糖含量达到了最大值5.51%，当继续增加料液比中液体占比时，多糖含量降低。综合考虑，料液比选择1∶20（g/mL）合适。

图3 料液比对多糖含量的影响

2.1.4 不同超声处理时间对香菇多糖含量的影响

由图4可知，随着超声处理时间的延长，香菇多糖含量增加，在超声处理时间为40 min时，多糖含量为5.57%，高于其他超声处理时间，随着超声处理时间延长，多糖含量降低。因此，超声处理时间选择40 min最为合适。

图4 超声处理时间对多糖含量的影响

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面结果

响应面试验根据单因素试验结果，以香菇多糖含量为响应值，依据Box-Behnken法进行试验方案设计，并对结果进行响应面分析，方案及结果见表2。

表2 响应面试验方案与试验结果

2.2.2 模型建立与方差分析结果

采用Design Expert 11软件对表2中的试验结果进行多项拟合回归，得到多糖含量Y对A、B、C的二次多项回归模型方程：Y=7.01+0.64A+0.35B+0.19C-0.06AB+0.055AC+0.31BC-0.4A2-1.19B2-1.27C2。

为了检验模型的有效性，区分各因素对香菇粗多糖含量影响的差异，对回归模型进行方差分析，结果如表3所示。其中，F值可以用来检验各变量对香菇多糖含量影响的显著性的高低。F值越高，相应变量的显著程度就越高。从表3可知，A、B、C三个工艺条件对香菇多糖含量影响的顺序从大到小为A＞B＞C，即表面活性剂＞料液比＞超声处理时间。模型的F值69.09，P＜0.000 1，差异极显著；失拟项P=0.211 7，差异不显著，这说明试验误差较小；相关系数R2=0.989 5，校正系数Radj2=0.976 0，说明响应值的变化98.95%源于所选因素，模型拟合度良好；变异系数（C.V.）=3.01，说明模型重现性好。一次项A、B的P值小于0.01，达到了极显著水平，C的P值小于0.05，达到了显著水平。根据图5～图7结合回归模型分析可知，BC交互作用相对明显。

表3 回归模拟各项方差分析

图5 表面活性剂添加量与超声处理时间的相互影响及等高线图

图6 表面活性剂添加量与料液比的相互影响及等高线图

图7 料液比与超声处理时间的相互影响及等高线图

2.3 验证试验

用Design-Expert 11软件对二次项回归模型进行预测得到最优提取条件：表面活性剂用量2.333%、料液比1∶20.475（g/mL）、超声处理时间44.158 min，预测多糖含量7.247%。为了实际操作时的可行性，修整提取工艺为超声处理时间40 min、表面活性剂用量2%、料液比1∶20（g/mL），在此条件下进行试验，3次重复，取平均值，测得香菇多糖含量为7.26%。该值与预测值接近，表明此工艺稳定可行。

3 讨论

香菇多糖是香菇中的有效活性成分，将香菇多糖开发成药物或保健产品逐渐成为一种研究趋势。通过表面活性剂协同超声提取香菇多糖，可以有效提高香菇多糖含量。在前人的试验基础上，通过单因素试验，研究表面活性剂添加量、料液比和超声处理时间三个因素对香菇中多糖含量的影响。在此基础上，利用Box-Behnken试验设计及响应面分析方法对表面活性剂协同超声法提取香菇多糖的工艺进行优化，以期探索更高效的提取香菇多糖的制备工艺。

单因素结果表明，表面活性剂添加量、料液比、超声处理时间均不宜过高，超过一定阈值后可能会破坏香菇多糖结构而使得多糖含量降低[20]。不同表面活性剂提取香菇多糖时，聚乙二醇-400提取的香菇多糖含量高于其他表面活性剂，其原因可能是聚乙二醇-400与蛋白分子形成次级键，降低蛋白质分子间的作用力[21-22]。这与韩伟等[23]研究表面活性剂协同微波提取白及多糖的工艺中表面活性剂的筛选结果类似。不同表面活性剂添加量提取多糖时，当添加2%聚乙二醇-400时，其多糖含量值高于其他添加量，其原因可能是当浓度小于2%时，随着表面活性剂添加量的增大，提取多糖效果增强，从而使细胞组织中多糖的溶出率增加，当浓度大于2%时，黏度过高，多糖得率下降[24-26]。不同料液比提取香菇多糖时，料液比为1∶20（g/mL）时，多糖含量高于其他料液比，其原因可能是料液比中液体占比的增大，加快了目标物质的溶出和扩散，料液比中液体占比继续增大会使其他成分溶出，抑制多糖溶出[27]。不同超声处理时间提取香菇多糖时，随着超声处理时间的延长，多糖的含量增加，在超声处理时间为40 min时，多糖含量达到最大，其原因可能是超声初期，超声波的“空化效应”促进多糖扩散至溶剂中，使得多糖在溶剂中充分溶解，然而随着超声处理时间的进一步延长，超声波的机械振动可能会使提取液中多糖分解，多糖分解成小分子糖，从而使多糖得率降低[28]。

应用Design-Expert软件探究表面活性剂添加量、料液比、超声处理时间三因素的交互作用，结果表明，超声处理时间和料液比交互作用显著，因此，表面活性协同超声提取香菇多糖工艺的最佳提取条件为超声处理时间40 min、表面活性剂用量2%、料液比1∶20（g/mL），此工艺条件下，多糖含量为7.05%。谢鹏等[29]研究表面活性剂协同双频超声波辅助提取香菇多糖工艺，结果发现在表面活性剂用量2.5%、超声频率（25+40）kHz、超声处理时间25 min时香菇多糖提取率为14.26%；钱春强等[30]研究了碱提法提取大球盖菇多糖，最佳工艺条件为提取温度85 ℃、碱液浓度0.03 mol/L、时间2 h，其多糖得率达到6.98%；马淑凤等[31]探求复合酶法提取白灵菇菌丝体多糖的最佳工艺，复合酶系组成为纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶、中性蛋白酶，质量比为3.0∶2.0∶0.5∶0.5。结果表明，酶用量2.53%、酶解温度39.6 ℃、酶解时间3.2 h、pH 7.2时，多糖最高得率可达8.23%。与其相比，研究进行了表面活性剂的筛选，多糖含量的测定方法为3, 5-二硝基水杨酸法，其多糖含量结果更为准确。相比于碱提取法和复合酶法，试验显著缩短了处理时间，操作简单易控，不用控制pH，节能环保。

4 结论

最优综合工艺为表面活性剂添加量2%、料液比1∶20（g/mL）、超声处理时间40 min。各因素的显著水平为表面活性剂用量＞料液比＞超声处理时间。在此条件下多糖含量理论值为7.247%，实际值为7.05%。因此采用响应面分析法建立模型优化得到的制备工艺参数准确可靠，可用于香菇多糖提取。通过此工艺研究，为香菇多糖的高效提取提供数据参考，也为其精深加工提供理论依据，促进香菇资源得到更多利用。