肺纤维化中内质网应激作用机制及中医药防治研究进展

李世霞,张旭辉,李红梅,杨亚茹

(1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000;2.甘肃中医药大学附属医院,甘肃 兰州 730099)

肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是遗传性易感个体在反复的肺泡损伤后,由于异常伤口愈合而导致的慢性炎症、细胞外基质成分胶原蛋白的过度沉积和肺组织瘢痕化发展而来的一种肺部疾病[1],是多种间质性肺疾病(Interstitial lung disease,ILD)的终末期表现,临床上最为常见且严重的是特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)。研究发现,PF的中位生存期约为诊断后的3～5年[2],年发病率约17.4/10万[3]。随着医学诊断技术水平的提高及人口老龄化不断进展,PF发病率越来越高,目前已成为呼吸系统难治性疾病之一。然而,目前对于PF具体发病机制仍然知之甚少,而且缺乏有效的治疗药物,西医治疗手段主要有药物治疗及肺移植手术治疗,主要治疗药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂、N-乙酰半胱氨酸及新型抗纤维化药物吡非尼酮和尼达尼布等,虽能在一定程度上控制疾病进展、延缓肺功能下降速度,但往往伴随着诸多不良反应,而肺移植手术治疗也因为供体器官缺乏、价格高昂等诸多因素导致在实际临床应用中难以实现。因此,积极研究治疗PF的新靶点以及寻找合适的治疗药物至关重要。在这种情况下,中医药治疗显现出独特的优势,中医药治疗具有辨证论治、整体审查等特色优势,而且不良反应较少,较易被患者接受,因此是治疗PF的一种新思路和新方法。

1 PF的中医认识

中医理论中并没有PF这一病名的明确记载,后世医家依据其主要症状和病机将其归属于“肺痿”“肺痹”“喘证”等范畴。近代许多医家根据前人治疗经验,结合自身多年临床实践,总结出治疗PF的新思想。名中医周平安提出肺气虚损、痰瘀浊毒为PF的内在病机,治疗当以益气扶正为主线,兼顾解毒祛邪、活血化痰等,标本兼治。国医大师晁恩祥认为PF基本证型为气阴不足,气机失畅,提出益气养阴、降气平喘为PF基本治法,同时根据其他伴随症状佐以宣肺止咳、清肺化痰、活血化瘀等法。刘华为认为肺气阴不足,气化失司,痰湿瘀结,气机失调为PF的病因病机。刘建秋认为本虚标实为PF主要病机,肺肾两虚为本,痰、瘀为标,提出了益气养阴、补肺健脾益肾、化痰祛瘀通络的治则;徐志瑛教授认为PF病机衍化特点为“肺蒙虚火-痰瘀互结-阳虚气衰”,治疗多用清热养阴、祛痰逐瘀、益气温肾之法。宋康基于络病理论,提出肺络痹阻、络虚不荣为PF基本病机,属本虚标实之证,以通补法为治疗原则,治疗当以化痰祛瘀、补益肺脾、滋阴补肾等。王鹏教授结合其临床特点及肺络虚积损的病机,并遵循叶天士“络以通为用”的治则,在临证中选用通络药来治疗PF,效果显著。山东省名中医刘德山将PF病机概括为气滞浊凝、肺络痹阻,并提出了疏散通络的治疗法则。李光熙认为本病为本虚标实之证,肺肾亏虚、正气不足为本,痰浊瘀血、痹阻肺络为之标,治疗应标本兼治,当补益肺肾、宣通肺气、化痰祛瘀。各位医家对PF看法各异,但整体而言PF发病以肺络虚损为主,气阴两伤,影响脾肾二脏,同时伴有痰浊、瘀血、毒邪等症,治疗当通补肺络,益气养阴,兼顾脾肾,同时佐以化痰、活血祛瘀、解毒祛邪之法。

近年来诸多研究发现,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)在PF的发生发展中起了重要作用。许多研究者以调控ERS为靶点,经过大量实验研究证实了中医药防治PF的可能机制,中医药治疗PF效果明显。因此本文综述了近年来中医药基于ERS治疗PF的研究进展,以期为今后临床探索以ERS为靶点治疗PF提供相关理论依据。

2 ERS发生机制

内质网(ER)是一种特殊的细胞器,位于真核细胞内,调节蛋白质的生物合成、折叠、脂质生物合成、细胞凋亡和钙稳态等是其主要功能[4]。ER内环境是否稳定对其发挥正常的生理功能有重要作用,也是整个细胞内环境稳定的重要基础。干扰ER内环境稳定的任何因素都可能引起错误折叠的蛋白质在ER中积聚,这一情况被称为ERS。ERS反应的感知和应答由未折叠蛋白反应(UPR)调控,UPR是一种为维持内质网蛋白质稳态进化而来的整合的适应性途径[5]。当发生ERS时,UPR的适应性机制被触发,使细胞恢复体内平衡,将ER恢复到正常生理状态。但是,在持续或严重的ERS情况下,UPR对细胞的恢复能力被打破,从而导致细胞死亡。UPR是一个复杂的信号传导途径,其主要通过三种效应途径介导,包括PKR样内质网激酶(PERK)、转录激活因子6(ATF6)和肌醇需求酶1α(IRE1α)的激活[6]。正常情况下,PERK、ATF6、IRE1α与其分子伴侣葡萄糖调节蛋白-78(Grp78),也称为免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)相结合形成无活性的复合物[7]。Grp78/BiP是热休克蛋白家族成员,对UPR有至关重要的调节作用。当错误折叠蛋白聚集时,GRP78/BiP则与PERK、ATF6和IRE1α这三个蛋白分离而激活UPR,以改善蛋白折叠,维持细胞内环境的稳定。然而,若ERS持续存在并加重,3个蛋白则会诱导激活相应的信号通路,导致细胞凋亡。

2.1 PERK通路 PERK是UPR的重要组成部分,也是ERS发生时蛋白质合成的关键调节因子,在UPR中PERK最先被激活[8]。PERK被激活后,磷酸化真核转录起始因子2α(eIF2α),从而通过抑制核糖体组装来全面抑制蛋白合成[9],使ER内的错误折叠或未折叠蛋白合成减少,从而稳定细胞内环境。但强烈的ERS可使磷酸化的eIF2α促进转录激活因子4(ATF4)中mRNA的选择性翻译,进而上调促凋亡因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达,诱导细胞的凋亡和自噬[10]。PERK-eIF2α-ATF4信号通路是CHOP蛋白表达所必需的,并诱导细胞凋亡。

2.2 ATF6通路 ATF6在哺乳动物细胞中以ATF6α和ATF6β两种亚型存在,并能诱导由IRE1α激活的转录因子X盒结合蛋白1(XBP1)的表达[11]。ATF6活化后从ER释放并到达高尔基体,随后被蛋白酶进行蛋白水解切割,释放NH2端结构域和ATF6p50,ATF6p50又被细胞质转运至细胞核,从而激活一系列ER蛋白的转录,如钙网蛋白、CHOP和XBP1的表达等[9,12]。

2.3 IRE1α通路 IRE1α二聚化并自身磷酸化,激活其内切核糖核酸酶活性,去除转录因子XBP1的内含子,将其转化为有活性形式的XBP1s[13]。XBP1s然后易位到细胞核并促进ERAD系统成分的转录,包括ER降解增强α-甘露糖苷酶样蛋白。活化的IRE1α既可以同二聚化,也可以寡聚化和自身磷酸化,寡聚的IRE1α内切核糖核酸酶活性降低,并通过IRE1α依赖性衰变过程促进mRNA以及微小RNA(miRNA)的普遍降解[6,14]。PERK、ATF6、IRE1α三个信号蛋白相互协同工作以在ERS环境中维持细胞的稳态。然而,若发生严重或长期的ERS,细胞稳态将被打破,从而发生细胞功能障碍和死亡。

3 ERS在PF中的作用机制研究

研究表明ERS可以通过调节肺泡上皮细胞凋亡、上皮-间质转化、肌成纤维细胞分化和M2巨噬细胞极化而影响PF的发生发展,成为促进PF发生发展的新的危险因素之一[15]。

3.1 肺泡上皮细胞凋亡 肺泡上皮细胞凋亡的ERS被认为可能是肺纤维化中细胞功能障碍的关键因素之一。长期或过度的ERS可通过几种UPR依赖的下游机制诱导上皮细胞凋亡,包括诱导CHOP、激活内质网结合的胱天蛋白酶(Caspase)或激活c-Jun NH2末端激酶(JNK)[15]。其中,CHOP的研究最为广泛成熟。Burman等[16]经过研究发现,CHOP对PF的影响反映在它对肺泡上皮细胞凋亡的影响方面,因此暗示CHOP诱导的肺泡上皮细胞凋亡是影响纤维化严重程度的重要机制。肺泡上皮细胞由Ⅰ型肺泡上皮细胞(AEC Ⅰ)和Ⅱ型肺泡上皮细胞(AEC Ⅱ)组成,二者共同参与构成肺上皮屏障,对肺组织的损伤修复具有十分重要的作用。其中,AECⅡ是维持肺泡结构和功能的关键细胞,反复损伤易致其功能异常及凋亡,从而引发上皮-成纤维细胞的异常互动,诱导成纤维细胞灶形成和大量细胞外基质沉积[17]。当AEC Ⅱ发生严重而持续的ERS时,超过了细胞自身的损伤修复能力,ERS相关信号通路被激活,CHOP表达因此升高,进一步诱导了AEC Ⅱ凋亡。因此,AEC Ⅱ的凋亡是PF病理进程的关键因素,ERS则是导致AEC Ⅱ凋亡的主要机制。

3.2 上皮-间质转化 上皮-间质转化是一种极化的不运动的上皮细胞向运动的间充质细胞转化的过程。ERS介导的上皮-间质转化参与博莱霉素诱导的PF过程,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达升高、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达降低是上皮-间质转化形成的标志之一[18]。Meng等[19]研究发现ERS可通过PERK信号通路而促进上皮-间质转化的发生,进一步诱导PF的发生发展。

3.3 肌成纤维细胞分化 ERS还通过影响成纤维细胞的肌成纤维细胞分化而与PF的发生发展相关。在受到多种促纤维化细胞因子刺激后,肺成纤维细胞可进一步分化为肌成纤维细胞,并导致大量胶原和基质成分产生,从而加速纤维化进程。UPR被激活后可促进转化生长因子-β(TGF-β)介导的肌成纤维细胞分化,其部分是通过IRE1α介导的miRNA调节,激活的IRE1α可以降解miR-150,其负调节α-SMA表达[20]。因此,抑制成纤维细胞分化可能是缓解PF的有效手段之一。

3.4 M2巨噬细胞极化 ERS也可以通过影响肺巨噬细胞表型来导致PF的发生。根据功能表型不同肺巨噬细胞可分为M1和M2两型,M1型巨噬细胞主要起促炎作用,M2型巨噬细胞则有抗炎活性,且在伤口愈合和纤维化中起到重要作用。在PF中,ERS可通过CHOP依赖性机制向M2极化倾斜,尽管现有的研究表明ERS对巨噬细胞极化的影响依赖于疾病背景,但肺巨噬细胞的ERS似乎有利于M2表型[15]。亦有研究发现,PF患者的M2型巨噬细胞中CHOP表达增高,CHOP在博莱霉素诱导的PF模型小鼠中可以诱导肺巨噬细胞向M2型极化,而CHOP缺陷小鼠在博莱霉素诱导后M2型巨噬细胞浸润大大减少[21]。

4 基于ERS中医药防治PF研究进展

4.1 单味中药及有效成分 雷公藤甲素是从雷公藤中分离而来的一种环氧二萜内酯化合物,是雷公藤的主要活性成分之一,生物活性十分广泛,可抗炎、抗肿瘤及免疫抑制。宋倩男等[22]研究发现雷公藤甲素可以通过调节纤维化肺组织实变区内AEC Ⅱ的GRP78和CHOP蛋白的表达,缓解ERS的压力,使AEC Ⅱ恢复正常功能,因此能改善小鼠肺功能,使肺间质胶原沉积减少,从而改善PF。

红景天苷是中药红景天的主要有效成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等药理活性,对肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、眼小梁网纤维化等多种器官或组织纤维化病变均有抑制作用[23]。黄玲等[24]研究发现红景天苷可以抑制博莱霉素诱导的ERS相关蛋白ATF4和XBP1的激活以及GRP78和CHOP的水平的升高,从而有改善PF的功效。

陈皮碱性提取物的活性成分主要为黄酮类物质和生物碱类物质。王志超[25]研究发现陈皮碱性提取物可以减轻AEC Ⅱ的ERS,并通过ATF3/PINK1信号通路使AEC Ⅱ线粒体趋于稳态,并且通过减少AEC Ⅱ中TGF-β1等细胞因子的分泌,而间接降低肺成纤维细胞的胶原沉积,最终缓解PF进程。

茯苓酸是一种三萜类化合物,是中药茯苓的主要活性成分,已被研究证实具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗癌、降血糖、镇静催眠等多种药理学作用。Li等[26]通过研究发现茯苓酸可以改善博莱霉素诱导的大鼠PF和组织病理学损伤,具体作用机制可能与其能抑制ERS和改善线粒体功能有关。

异鼠李素是广泛存在于银杏、沙棘中的一种黄酮醇类化合物。现代药理研究表明其具有抗炎、抗氧化、保护内皮细胞等多种生物学功能。Zheng等[27]研究发现异鼠李素在体内和体外均能改善小鼠PF,可能与其通过抑制PERK信号通路而缓解ERS有关。

牛磺熊去氧胆酸是熊胆汁中提取的主要有效成分,研究表明其具有保肝、利胆、溶石、抑制ERS、抗凋亡等多种药理学作用。Omura等[28]研究发现牛磺熊去氧胆酸可通过抑制人肺上皮A549细胞中ERS相关的细胞死亡而抑制百草枯诱导的PF的发生。

4.2 中药复方或制剂 补肾益肺消癥方(当归、熟地黄、 陈皮、法半夏、 浙贝母、水蛭、炙甘草)以补益肺肾、祛瘀化痰解毒为法,由经典名方金水六君煎化裁而成。吴甜甜等[29]研究证实补肾益肺消癥方可抑制纤维增生及瘢痕形成,延缓肺间质纤维化进程,具体机制可能是其能下调JNK信号传导通路关键因子的基因表达及蛋白含量,缓解ERS,减少AEC Ⅱ的损伤和凋亡。此后,高伟华等[30]研究发现补肾益肺消癥方可以改善PF大鼠肺组织内质网扩张和扭曲程度,并能通过下调CHOP凋亡通路中关键信号分子CHOP、PERK等在蛋白及基因水平的表达,而调控AEC Ⅱ细胞ERS、恢复细胞内环境的稳态、减少和抑制AEC Ⅱ细胞凋亡,从而减缓肺组织纤维化。杨颖溪等[31]也发现补肾益肺消癥方可以通过减少α-SMA的表达及成熟肺表面活性物质相关蛋白C沉积,减少成纤维灶的形成,抑制ERS反应,延缓PF的病理进程,从而达到治疗的目的。张沂等[32]证实补肾益肺消癥方可通过缓解AEC Ⅱ中持续的ERS及其诱导的Caspase12凋亡信号通路中关键蛋白的表达,减少AEC Ⅱ的凋亡,延缓PF的病理进程。贺晋芳等[33]实验研究也发现补肾益肺消癥方可抑制肺泡上皮细胞的间质转化,并通过减轻持续的ERS,抑制AEC Ⅱ的凋亡,达到延缓PF病理进程的治疗作用。综上所述,补肾益肺消癥方可抑制PF大鼠肺组织的ERS反应,减少和抑制AEC Ⅱ细胞凋亡,减轻大鼠肺组织的损伤程度,延缓疾病进展,但目前研究有限,更深入的作用机制还有待进一步挖掘。

朱国双等[34]经动物实验证实温肺化纤颗粒(熟地黄、鹿角霜、炮姜炭、肉桂、麻黄、炙甘草、白芥子、土鳖虫、桃仁、红花、川芎、地龙)具有抑制PF的作用,其机制可能是通过抑制ERS介导的凋亡发生,从而减少上皮间质转化。林家猛等[35]证实张仲景《金匮要略》中的经典方剂瓜蒌薤白汤(瓜蒌、薤白)治疗博莱霉素诱导的大鼠PF,可能与抑制ERS的3条通路PERK、ATF6及IRE1α有关。邱岳[36]经研究证实肺肾气虚是PF的主要中医证候,且肺肾气虚证患者中多伴有肾阳虚的症状,用右归饮(熟地黄、枸杞子、山茱萸、炒山药、炙淫羊藿、黑顺片、肉桂、炙甘草)可改善ERS介导的细胞凋亡,从而延缓PF疾病进程,可在一定程度上改善模型大鼠通气功能障碍,且能改善肺泡的气体交换功能,降低肺组织炎性浸润及胶原沉积情况。申萌萌等[37]研究发现麦门冬汤(麦冬、半夏、人参、粳米、炙甘草、大枣)能够明显改善模型大鼠肺功能障碍,减少间质胶原沉积,可能与调节PF大鼠肺组织AEC Ⅱs的GRP78和CHOP蛋白表达,减轻ERS压力,恢复AECⅡs的正常功能有关。韩冰等[38]研究证实丹芍化纤胶囊(汉防己甲素、丹参、赤芍、黄芪、银杏叶)能抑制肺组织中GRP78及NF-κB的表达,从而减轻ERS所引起的损伤,而对PF有干预作用。谢汝佳等[39]也证实丹芍化纤胶囊能提高肺组织SOD酶活性,对抗氧化应激以及抑制肺组织中GRP78的表达,从而减轻ERS反应,进而延缓PF。

痰热清注射液是传统中药制剂,由黄芩、熊胆粉、山羊角、忍冬藤、金银花、连翘等中药的提取物制成,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗病毒等多种药理作用,广泛应用于肺部疾病,如肺炎、慢性阻塞性肺疾病、PF等。Deng等[40]研究发现痰热清注射液可通过抑制ERS信号通路而改善博莱霉素诱导的大鼠PF模型的肺损伤、肺水肿和肺功能,减轻胶原合成和沉积,下调α-SMA、上调E-cadherin蛋白的表达,从而有改善大鼠PF的作用。

5 小 结

综上所述,诸多学者经研究证实无论是单味中药及有效成分还是中药复方或制剂均能以ERS为靶点调控ERS关键因子和通路,对PF有不同程度的治疗作用,为PF的防治提供新的思路。因此,以中医药防治PF是今后PF治疗的新途径。然而,ERS是一个复杂的信号传导过程,目前的实验研究还未能完全探索出其在PF中的具体机制。而且现有的研究以动物实验为主,细胞实验极少,未来研究方向将以细胞实验甚至是临床试验为突破点,以期为PF患者治疗提供新的契机。