延胡索HPLC指纹图谱评价及含量测定研究

李强，程艳芹，崔晓博，刘杨，刘旭

(中国人民解放军海军九七一医院，山东 青岛 266071)

延胡索(Corydalisyanhusuo)，又称延胡、元胡、元胡索，是罂粟科植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)干燥块茎。延胡索性质温和，味辛且苦，归肝及脾经，具有活血、行气、止痛的功效[1-2]。近代医药学的研究发现，延胡索中包含60余种生物碱和20余种非生物碱类化合物，成分非常复杂，其中的生物碱是其主要的活性成分，具有镇痛、抗心律失常、抗溃疡、抗菌抗病毒等药理作用[3-4]，是现代中药制剂的常用药材，在中医药领域应用广泛。该药材原产于浙江，近年来在河南、江苏等地大量种植，也有多种同属植物的块茎在部分地区作元胡药用，种类繁杂。文献资料中延胡索药材的相关研究多以标志性成分延胡索乙素单一指标为考察对象，不足以全面地反映药材的质量[5-6]。因此，建立有效的延胡索药材质量评价方法，确保延胡索药材质量稳定，直接关系到延胡索相关药品和临床处方的疗效。本试验采用高效液相色谱(HPLC)法建立延胡索的指纹图谱，同时对原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索甲素、延胡索乙素6种生物碱含量进行研究分析，为进一步考察6种不同产地延胡索药材的质量状况提供了更为全面的图谱信息，为延胡索药材整体的质量评价提供了新的借鉴和参考。

1 材料和设备

1.1 药品和试剂 乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20200731)；甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20200924)；磷酸(分析纯，莱阳市康德化工有限公司，批号：2019081)；三乙胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20200827)；浓氨水(分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：20190920)；灭菌注射用水(山东齐都药业有限公司，批号：2019062002)；延胡索甲素(上海源叶生物科技有限公司，批号：Z25N8B49010)；延胡索乙素(成都化夏化学试剂有限公司，批号：P550201)；盐酸巴马汀(北京索莱宝科技有限公司，批号：SP8050)；原阿片碱(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y12J10L90499)；脱氢紫堇碱(上海源叶生物科技有限公司，批号：W13M8Z31183)；盐酸小檗碱(北京索莱宝科技有限公司,批号：SP8140)；延胡索药材来源见表1。

表1 延胡索药材来源

1.2 仪器和设备 液相色谱仪LC-2030型(日本岛津制作所)；超声波仪SY2200-SB2200型(上海必能信超声有限公司)；电子天平YP202N型(上海精密科学仪器有限公司)；电子天平DV215CD型(美国奥豪斯公司)；循环水真空泵SHZ-DⅢ型(巩义市予华仪器有限责任公司)；电热恒温水箱HH-W21-420型(余姚市亚星仪器仪表有限公司)；酸度计PHS-3E型(上海仪电科学仪器股份有限公司)；红外线干燥箱70-1型(龙口市电炉制造厂)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)(三乙胺调pH值至 6.1)；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃[4]，流动相梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱流动相变化时间程序

2.2 供试品溶液的制备 精密称取已粉碎的药材粉末1 g于圆底烧瓶中，精密加入浓氨-甲醇(1∶20)50 mL，称重，冷浸1 h，超声40 min，取出静置冷却，再次称重，并用浓氨-甲醇(1∶20)补充损失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL于坩埚中，在水浴锅中蒸干，取得的残渣加甲醇溶解，并转移至10 mL容量瓶中，稀释至刻度，充分摇匀，微孔滤膜滤过即得。

2.3 混合对照品溶液的制备 精密称取6种生物碱对照品适量，加甲醇超声(功率：500 W，频率：59 kHz，下同)溶解，制成每1 mL含原阿片碱17.75 μg、盐酸巴马汀19.65 μg、盐酸小檗碱10.10 μg、脱氢紫堇碱61.70 μg、延胡索乙素58.00 μg、延胡索甲素46.45 μg的混合对照品溶液，密封后放入冰箱内冷冻保存，备用。

2.4 单个生物碱对照品溶液的制备 分别精密称取原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素对照品药物适量分别于不同的10 mL容量瓶中，分别加适量甲醇摇匀，超声溶解，用甲醇分别定容，制得原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素质量浓度分别为0.104 2、0.096 6、0.101 6、0.100 2、0.101 0、0.110 8 mg·mL-1的单个对照品溶液，密封后放入冰箱内冷藏保存，备用。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 精密度试验 取相同的延胡索供试品溶液，按照规定的色谱条件，连续进样6次并记录所得色谱图，比较脱氢紫堇碱的色谱峰的相对峰面积和相对保留时间，所得RSD值均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取相同的延胡索供试品溶液，按照规定的色谱条件，在0、3、6、9、12、24 h分别进样分析并记录所得色谱图，比较脱氢紫堇碱的色谱峰的相对峰面积和相对保留时间，所得RSD值均小于2%，表明延胡索供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取相同批次的延胡索样品6份，分别配置供试品溶液后按照规定的色谱条件进样分析并记录所得色谱图，比较脱氢紫堇碱的色谱峰的相对峰面积和相对保留时间，所得RSD值均小于2%，表明重复性良好。

2.5.4 指纹图谱的生成 取6批不同产地的延胡索样品按照“2.2.2”项下制成的供试品溶液，按照规定的色谱条件进样分析并记录75 min色谱图。取6种生物碱制成的混合对照品溶液，按照规定的色谱条件进样分析并记录75 min色谱图。取各生物碱对照品6种分别配置单个生物碱对照品溶液，按照规定的色谱条件进样分析并记录75 min色谱图。对比指纹图谱除溶剂峰外共确定有12个共有峰，经过进样剖析单个生物碱对照品后获得的色谱图，如图1～3，确定其中6个色谱峰，按序号1、2、3、4、7、9分别为原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素。以脱氢紫堇碱为参照峰，各共有峰相对保留时间和相对峰面积见表3～4。

图1 6批不同产地延胡索药材指纹图谱

1.原阿片碱；2.盐酸巴马汀；3.盐酸小檗碱；4.脱氢紫堇碱；7.延胡索乙素；9.延胡索甲素

表3 6批延胡索药材样品中共有峰相对保留时间

表4 6批延胡索药材样品中共有峰相对峰面积

2.5.5 指纹图谱相似度分析 对6批不同产地药材指纹图谱利用“中国色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行相似度分析，结果6批药材(S1～S6)与对照图谱(SR)相似度分别为0.976、0.922、0.953、0.981、0.943、0.992。提示6种不同产地的延胡索药品指纹图谱差异较小。

2.6 延胡索中6种生物碱的含量测定

2.6.1 系统适用性试验 取延胡索供试品和混合对照品溶液，按照规定的色谱条件进样分析并记录75 min色谱图。分析结果表明，6种生物碱的分离度均大于1.5。

2.6.2 线性关系考察 取相同的延胡索混合对照品溶液，分别精密吸取2、5、10、15、20、25、30、35 μL进样分析并记录75 min色谱图，测出6种生物碱的峰面积，以对照品溶液进样量作自变量X，以生物碱相应峰面积作因变量Y做线性回归，结果显示，6种生物碱均具有良好的线性关系。

2.6.3 精密度试验 取相同的延胡索混合对照品溶液，按照规定的色谱条件重复进样分析6次并记录所得色谱图，测出6种生物碱的峰面积RSD值均小于2%，表明仪器精密度良好。

A.原阿片碱；B.盐酸巴马汀；C.盐酸小檗碱；D.脱氢紫堇碱；E.延胡索乙素；F.延胡索甲素

表5 6种生物碱线性关系考察表

2.6.4 稳定性试验 取相同的延胡索供试品溶液，按照规定的色谱条件，在0、3、6、9、12、24 h分别进样分析并记录所得色谱图，测出6种生物碱的峰面积所得RSD值均小于2%，表明延胡索供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.5 重复性试验 取相同批次的延胡索样品6份，分别配置供试品溶液后按照规定的色谱条件进样分析并记录所得色谱图，测出6种生物碱的峰面积所得RSD值均小于2%，表明重复性良好。

2.6.6 加样回收率试验 精密称取同一批延胡索样品(批号：20200511)6份各0.5 g，置于平底烧瓶中，精密加入6种生物碱对照品适量，分析测定。结果显示，原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素的平均加样回收率分别为：101.6%、99.9%、100.5%、99.0%、100.2%、102.2%，其RSD分别为：1.6%、1.3%、0.6%、1.5%、2.3%、1.7%(见表6)。

表6 延胡索6种组分加样回收率试验结果

2.6.7 样品测定 取延胡索样品制成的供试品溶液，按照规定的色谱条件进样分析并记录75 min色谱图并计算出样品中各6种生物碱含量见表7(为6批不同产地药材各生物碱的平均含量)。

表7 延胡索各组分含量测定结果(mg·g-1,n=6)

3 讨论与结论

3.1 供试品溶液制备条件的筛选 采用单因素法，以原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素、延胡索甲素6种生物碱色谱峰为考察指标，对超声和加热回流提取30 min两种提取方法进行比较，结果表明超声提取所得的生物碱含量较高，因此选用超声提取方式对药材进行制备；此外，又分别选择甲醇、70%甲醇、浓氨-甲醇(1∶20)对提取溶剂进行考察，结果表明浓氨-甲醇(1∶20)所得的生物碱含量较高，因此选用浓氨-甲醇(1∶20)作为溶剂进行提取；采用浓氨-甲醇(1∶20)作提取溶剂分别超声提取20、40、60 min，结果表明超声提取40 min和60 min生物碱含量较超声提取20 min高，且二者之间无明显差别，因此选用超声40 min作为供试品提取制备方式。

3.2 色谱条件的选择 通过对比流动相[甲醇A-0.1%磷酸溶液B、乙腈A-0.1%磷酸溶液B、乙腈A-水B(每100 mL水中含有1 mL pH=6.0的醋酸-醋酸铵缓冲溶液)]、流动相pH(6.0、6.1、6.2)、检测波长(230、250、280 nm)及柱温(25、30、35 ℃)等色谱条件，经过图谱分析后筛选出流动相：乙腈A-0.1%磷酸溶液B(三乙胺调pH值至 6.1),检测波长：280 nm，柱温：30 ℃为最优检测条件，所得色谱峰分离度良好，无拖尾现象。

3.3 指纹图谱方法学验证及相似度分析 本试验建立了延胡索药材HPLC指纹图谱，并考察比较了6批不同产地延胡索药材的指纹图谱相似度。经过方法学验证，该HPLC方法精密度高，重复性好，稳定准确，特征突出，可行性好。

本试验所采用的延胡索为我国南方地区的延胡索生品，试验结果显示，指纹图谱共成功匹配12个共有峰，共有峰基本特征均一致，为延胡索药材的鉴别及生物碱成分的含量测定提供了相对全面的参考信息，对延胡索药材质量标准的制定具有一定的借鉴意义[5]。图谱比较后发现，6批不同产地的延胡索药材指纹图谱相似度较高，提示这几个地区延胡索药材质量差异不大。这可能与延胡索药材产地空间距离较近，产地之间土壤、光照、气候等地理因素差异较小，药材采集时间，采集方式和储存条件相对一致等因素密切相关，具体原因有待进一步分析研究。