基于中红外技术的大蓟及小蓟鉴别研究

张诗华，郭朝晖，倪琳，宋平顺，李辰荃

(1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省药品检验研究院，国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室，甘肃省中药品质与安全评价工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070)

大蓟为菊科植物蓟(CirsiumjaponicumFisch.ex DC.)的干燥地上部分。通常在夏、秋二季大蓟花开时收割干燥地上部分，除去杂质并干燥。其性味甘、苦，凉。在临床上常用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏，外伤出血，痈肿疮毒。小蓟为菊科植物刺儿菜[Cirsiumsetosum(Willd.)MB.]的干燥地上部分[1]。大蓟和小蓟在全国各地均有栽培，由于市场流通混乱，常将小蓟作为大蓟进行交易，导致临床药效参差不齐。二者虽均能凉血止血，解毒消痈，主治血热型出血，热毒疮疡，但是小蓟凉血止血作用强，解毒之力不如大蓟；大蓟凉血止血作用不如小蓟，而解毒疗疮作用较强[2]。所以大蓟和小蓟在临床上不得混用。

当前中药鉴别方法包括传统鉴别方法和现代鉴别方法，传统鉴别方法主要是利用触觉、嗅觉、视觉、味觉等感官方法，或火试、水试等方法进行鉴别，对中药饮片的种类、真伪等加以判断；现代鉴别方法主要是采用显微技术，利用组织鉴别法、粉末鉴别法、化学分析方法等进行显微分析[3]。这些方法操作简便，但准确率有待商榷。同时中药及其中药制剂所含化学活性成分复杂多样，对所有化合物进行定性定量也十分困难，而且某些活性成分在治疗方面也具有协同加和作用[4]，因此单一成分含量也不能准确的评价中药质量。

中红外光谱指纹图谱目前已经应用于中药活性成分，真伪鉴别、质量控制等方面的研究[5-12]。TQ、SIMCA两款软件可对光谱进行分析，目前TQ软件已经在前胡的快速鉴别[13]、三七的真伪鉴别[14]、天麻有效成分的快速定量[15]等方面中有所应用。SIMCA判别分析也已经在不同产地山药的鉴别[16]、金银花与山银花的区分判别[17]、硫熏白芍的快速鉴别[18]等方面广泛应用。

本实验通过收集不同产地的大蓟及小蓟样品，采集大蓟与小蓟的中红外光谱，利用TQ软件和SIMCA软件建立主成分分析-马氏距离与正交偏最小二乘判别模型，为鉴别大蓟与小蓟及质量评价提供一定参考。

1 仪器与材料

1.1 样品收集 2021年共收集44份不同产地的大蓟及小蓟样品，样品信息见表1。本研究中的大蓟、小蓟样品均由甘肃省药品检验研究院宋平顺主任药师收集并鉴定。经过观察发现大蓟及小蓟样品的表面颜色、叶片形状等性状差异性较小，如果仅凭肉眼观察和显微观察无法准确地区分。

表1 大蓟和小蓟样品信息

为了方便区分，将所有样品编号后，统一进行干燥。具体干燥方法是将大蓟、小蓟样品在45 ℃烘箱中干燥12 h，每4 h翻动一次。干燥处理后将样品放置于真空干燥器中冷却至室温。将干燥后的样品粉碎并过80目筛，以得到大小均一的大蓟和小蓟粉末，粉末样品保存于自封袋中，放阴凉干燥处贮存备用。

1.2 仪器 PC-12型号压片机(天津精拓仪器科技有限公司);Spectrum Two傅立叶变换红外光谱仪(PerkinElmer北京仪器有限公司)；A11basic025冲击式粉碎机(德国IKA)；QUINTTX224-1CN万分之一天平(德国赛多利斯)；JB2018940标准检验筛(绍兴市张兴纱筛厂)；9240A型号电热鼓风干燥箱(北京兰贝石恒温技术有限公司)。

1.3 样品处理 取粉碎后的样品置于研钵，加入溴化钾(光谱级)研磨后放置于高温灯下备用。每扫描一个样品均采集一次背景，一批样品在相同条件下进行5次扫描。参数设定：光谱扫描范围在4 000～400 cm-1，扫描次数14次，温度20 ℃，空气相对湿度70%；扫描时扣除H2O和CO2的干扰，每种样品平行测量5次，取平均光谱[19]。大蓟及小蓟样品原始中红外光谱图见图1～4。

图1 大蓟样品原始中红外光谱

1.4 方法学验证 选取随机样品进行方法学考察，选取中红外光谱中吸收强度最大的5个特征峰作为评价峰，考察仪器的精密度、样品的稳定性、操作可重复性，以对应波长的相对标准偏差最为评判依据。

1.4.1 精密度试验 样品连续测定5次，得到红外光谱并计算RSD值，结果显示RSD值均小于1.45%，表明仪器的精密度良好。

1.4.2 稳定性试验 取同一样品压片，压片后放入真空干燥器中进行保存。每隔30 min进行一次光谱采集，测定5次，得到红外光谱并计算RSD值，结果显示RSD值均小于1.89%，表明该样品的稳定性良好。

1.4.3 重复性试验 将样品平行制样5份，分别进行测定，得到红外光谱并计算RSD值，结果显示图谱RSD值均小于0.99%，表明方法的可重复性良好。

2 光谱分析结果

由图可知，大蓟和小蓟样品中红外原始光谱存在以下特征：整体可见，不同产地的大蓟和小蓟中红外光谱走势和主要吸收峰的位置基本相同，说明不同产地的大蓟以及不同产地的小蓟质量总体稳定。4 000～1 300 cm-1称为官能团区，1 300～600 cm-1的区域，除单键的振动外，还有因变性振动产生的复杂光谱，这一区域称为指纹区。

由图2大蓟图谱可以看出，其中3 010.4 cm-1处的峰为C-H伸缩振动吸收峰；2 864.7 cm-1处的峰是甲基的对称伸缩吸收峰；1 718.2 cm-1为羰基C=O伸缩振动吸收峰；1 490.3 cm-1和1 525.1 cm-1附近为芳香环骨架振动吸收峰；1 389 cm-1与1 347.8 cm-1为C-H弯曲振动吸收峰；1 300～910之间主要为各类C-O的伸缩振动。

图2 大蓟样品红外光谱及吸收峰图

由图4小蓟图谱可以看出3 000.4 cm-1处的峰为C-H伸缩振动吸收峰，2 861.4 cm-1处的峰是甲基的对称伸缩吸收峰，1 715 cm-1为羰基C=O伸缩振动吸收峰，1 487.5 cm-1和1 557 cm-1附近为芳香环骨架振动吸收峰，1 389.6 cm-1与1 348.6 cm-1为C-H弯曲振动吸收峰，1 300～910 cm-1之间主要为各类C-O的伸缩振动，通过对比可以看出，小蓟在1 557cm-1、754.78 cm-1和489.33 cm-1附近有吸收峰，而大蓟在这几处的峰不显著，大蓟在907.6 cm-1附近有吸收峰，而小蓟在此处吸收不明显。

3 建立模型

3.1 主成分分析-马氏距离(PCA-MD)判别模型 使用TQ Analyst软件对光谱进行优化处理，光谱中除了样本本身信息之外，还包括了一些无用信息，噪声等，因此本文采用多元散射校正法(MSC)、标准正态变量变换(SNV)、一阶导数(FD)、二阶导数(SD)、SG平滑、ND平滑的组合方法去除光谱中存在的无用信息[20]，以提高判别模型的准确性。通过表2可知，通过分析选择的预处理方法为MSC+ND+SD。

在对原始光谱预处理的基础上采用主成分分析-马氏距离判别分析方法，选取的光谱范围为3 930.22～520.69 cm-1，从中选取8个为验证集，212个为预测集。判别模型结果见表2和图5。在表2中可见模型的性能指数(performance index)为95.7，其预测率(previous)为95.0，表明建立的PCA-MD判别模型是合理有效的，MSC+ND+SD可以作为大蓟和小蓟光谱的有效处理方法。如图5所示，可以看出大蓟样品和小蓟样品有良好的区分度。

表2 光谱预处理方法

图3 小蓟样品原始中红外光谱

图4 小蓟样品红外光谱及吸收峰图

图5 PCA-MD判别模型图

3.2 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)判别模型的建立 采用SIMCA 14.0软件，建立大蓟与小蓟样品的正交偏最小二乘法判别模型，OPLS-DA模型中的R2Y代表积累的自变量X对Y的解释能力，Q2代表模型的预测能力。在所设计的模型中R2Y的值为0.95，Q2的值为0.944，OPLS-DA模型判别结果见图6，由图6可知，大蓟与小蓟的中红外光谱信息是具有差异性的。在OPLS-DA模型建立的基础上，采用SIMCA软件对其进行置换检验，排列数为200，结果见图7。由图7可知，R2的截距值为0.037 2，Q2的截距值为-0.179<0.05，表明所建立的模型是稳定有效的，且没有过度拟合，可用于判别大蓟及小蓟样品。

图6 OPLS-DA模型判别结果

图7 置换检验结果

4 讨论

目前对大蓟小蓟的区分鉴别集中在显微和含量成分测定方面。易炳学等[21]测定大蓟小蓟中含量发现柳穿鱼叶苷可以作为大蓟和小蓟药材区别的依据。倪晓霓等[22]建立了反向高效液相色谱分析方法，利用大蓟、小蓟黄酮类化合物的指纹图谱来鉴别二者。胡建平等[23]利用聚酰胺薄层色谱法进行层析，以此来鉴别大蓟。梁鹂等[24]对大蓟与小蓟的显微进行鉴别研究，发现大蓟、小蓟的横切面显微特征可从茎及叶维管束排列紧密程度来进行区分;粉末的显微特征可从多细胞非腺毛的细胞个数来进行区分。张景景等[25]研究表明ITS2序列可以鉴定大蓟药材。但以上方法操作均较为复杂。

本研究中所用到的PCA-MD与OPLS-DA 模型均是模式识别的方法，其中PCA-MD为无监督的方法，主成分的提取是采用降维的方法，提取出有用的光谱信息，本实验中所建立的PCA-MD 判别模型对大蓟和小蓟的鉴别率仅达到 95.0%，因此建模波段与建模方法需进一步优化以便实现准确区分。而 OPLS-DA为有监督的方法，由于OPLS-DA方法同时对光谱阵和类别阵进行分解，加强了类别信息在光谱分解时的作用，以提取出与样本类别最相关的光谱信息，即最大化提取不同类别光谱之间的差异[26]，因此 OPLS-DA方法通常可以得到比基于 PCA 的识别方法更优的分类和判别结果，基于此进一步对光谱波段进行了优化，建立了OPLS-DA判别模型并对其进行验证，发现该模型鉴别率能够达到94.4%。

本研究首次通过中红外光谱实现了对大蓟和小蓟样品的准确鉴别，该方法操作简单，建立的判别模型准确可靠，可为相似中药材的鉴别提供新的思路。