广东佛山地区田间烟粉虱的隐种鉴定及带毒率检测

林晓涛 王依娜 张可国 钟泽鑫 刘雅婷

（佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山 528000）

烟粉虱〔Bemisia tabaci（Gennadius）〕属半翅目（Hemiptera）粉虱科（Aleyrodidae），是一种入侵性强、危害性大的世界性农业害虫，已入侵除南极洲外的100 多个国家和地区（Boykin et al.，2007；Wang et al.，2010），是一个快速进化的复合种（de Barro et al.，2011），目前推测的烟粉虱隐种已达40 个（郑慧新，2021）。我国报道的烟粉虱隐种有15 个，其中MEAM1 和MED 隐种是我国许多地区的优势种（刘银泉和刘树生，2012）。MEAM1隐种于20 世纪90 年代传入我国，并在南方地区烟草、番茄等多种作物上为害严重（罗晨 等，2002；Wu et al.，2002）。MED 隐种于2003 年首次在云南被发现，其后陆续在北京、山东、河南等地发生为害（褚栋 等，2005；Chu et al.，2006）。近年来，MED 隐种凭借超强的环境适应性和化学药剂抗药性在我国境内迅速扩散，逐渐取代MEAM1 隐种成为我国主要优势种群（Teng et al.，2010；Hu et al.，2011；Pan et al.，2011；Zheng et al.，2017）。

烟粉虱的危害不仅表现在刺吸植物汁液，造成植物枯萎，分泌蜜露，造成煤污病；还表现在传播多种植物病毒病上（谈星 等，2021）。研究表明，烟粉虱可以传播200 余种植物病毒，包括番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）和番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）（Jones，2003；卫 静 等，2015）。TYLCV是危害全球番茄产量最严重的DNA 病毒，属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。该病毒1939 年在以色列首次发现，并于2002 年传入我国，随后迅速蔓延至我国各省份（李延刚和李长松，2011）。TYLCV 主要危害茄科、豆科蔬菜，作物感染该病毒后，出现叶片黄化、植株矮化、果实僵化等症状，严重影响作物的产量和品质（刘晨 等，2016）。ToCV 与TYLCV类似，可侵染番茄、茄子等茄科植物，是长线形病毒科（Closteroviridae）的一种RNA 病毒。该病毒1998 年首次在美国佛罗里达州被发现，2012 年在我国北京检测到后，迅速扩散至我国多个省份（Zhao et al.，2013）。ToCV 可导致感染植株发育受阻、果实减产，造成严重的经济损失（Wintermantel &Wisler，2006）。

在自然条件下，TYLCV 和ToCV 不能在植物之间传播，只能依靠昆虫媒介如烟粉虱进行传播（Rubinstein &Czosnek，1997；Wisler et al.，1998）。郑慧新等（2016）研究指出，TYLCV 和ToCV 在我国的流行暴发与烟粉虱的大规模入侵密切相关。因此，了解各地区烟粉虱的入侵情况及其携带TYLCV 和ToCV 病毒的情况，有助于科学制定控制烟粉虱的有效策略，为我国TYLCV 和ToCV 的综合防控提供科学指导。

本试验采集了广东省佛山市6 个地点的烟粉虱样本，通过DNA、RNA 提取及PCR 扩增，检测了佛山地区田间烟粉虱MED 和MEAM1 隐种的种群分布情况及其TYLCV 和ToCV 的带毒率，以期为佛山地区田间有效且可持续地防治烟粉虱及其携带的病毒病提供全面、科学的依据。

1 材料与方法

1.1 烟粉虱样本的采集

2021 年9—11 月在广东省佛山市6 个地点采集烟粉虱，田间采集样品信息详见表1。各点采集样本数量均≥ 200 个，将采集样本（活体）置于5 mL 离心管中，-80 ℃保存。

表1 烟粉虱田间采集样品信息

1.2 烟粉虱隐种鉴定

分别从各地点采集的烟粉虱样本中随机选取20 头成虫，利用DNA 提取试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕提取单头烟粉虱的DNA。根据Chu 等（2005）的方法，PCR 扩增mtCOI基因，引物序列见表2。使用限制性内切酶AseI 进行酶切处理，电泳检测，根据酶切的片段大小确定隐种。若AseI 成功将mtCOI片段酶切成2 个不同长度的片段（498 bp，122 bp），则表明样本为MED 隐种；若AseI 酶切后，mtCOI片段仍为620 bp，则表明样本为MEAM1 隐种。为了验证试验结果的准确性，在每个地点样本中随机选取1～2 个个体，PCR 扩增后送北京擎科生物技术有限公司测序验证。

表2 供试引物信息

1.3 烟粉虱TYLCV 带毒率检测

分别从各地点采集的烟粉虱样本中随机选取20 头成虫进行TYLCV 带毒率检测。以单头烟粉虱DNA 为模板，使用TYLCV 的特异性引物进行PCR 扩增，引物序列见表2。PCR 反应体系 为20 μL：PCR Mix 10 μL，TYLCV-61 1 μL，TYLCV-473 1 μL，烟粉虱DNA 模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，循环30 次；72 ℃ 15 min。PCR 产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统上观察结果。

1.4 烟粉虱ToCV 带毒率检测

分别从各地点采集的烟粉虱样本中随机选取20 头左右成虫进行ToCV 带毒率检测。使用TRIzol试剂（Invitrogen 公司）提取单头烟粉虱总RNA。使用NanoDrop 2000 超微量分光光度计（Thermo Scientific）对RNA 进行定量，并采用1% Tris/硼酸盐/EDTA（TBE）琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。根据说明书的指示，采用TaKaRa 公司的反转录试剂盒PrimerSprit®RT Reagent Kit 进行cDNA 合成，合成的cDNA 立即使用或-20 ℃保存备用。

以单头烟粉虱cDNA 为模板，使用ToCV 的特异性引物进行PCR 扩增，引物序列见表2。PCR反应体系为20 μL：PCR Mix 10 μL，ToCV-172 1 μL，ToCV-610 1 μL，cDNA 模板1.5 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR 反应条件为：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，循环30 次；72 ℃ 10 min。PCR 产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统上观察结果。

2 结果与分析

2.1 烟粉虱隐种鉴定

由图1 可知，佛山市三水区番茄寄主上采集的烟粉虱种群全部为MED 隐种，禅城区、南海区、顺德区均为MED、MEAM1 混合种群。其中，除南海区狮山镇石门中学和南海区佛山科学技术学院外，其余地点的优势种均为MED 隐种，占比≥85%（表3）。表明，在广东省佛山地区，田间烟粉虱主要以MED、MEAM1 种群混合发生，且MED隐种为多数地点的主要发生种。

图1 佛山地区烟粉虱隐种鉴定情况

表3 佛山地区烟粉虱隐种分布情况

2.2 烟粉虱TYLCV 带毒率检测结果

由表4 可知，佛山6 个地点的田间烟粉虱样品均携带TYLCV，且除南海区狮山镇石门中学外，其余地点的烟粉虱TYLCV 带毒率均大于50%。表明TYLCV 经烟粉虱传播，已在佛山地区扩散。

表4 佛山地区烟粉虱TYLCV 带毒情况

2.3 烟粉虱ToCV 带毒率检测结果

由表5 可知，佛山6 个地点的田间烟粉虱样品均携带ToCV，且除南海区丹灶镇金沙上安村外，其余地点的烟粉虱ToCV 带毒率均达到100%。表明，ToCV 经烟粉虱传播已在佛山地区迅速蔓延。

表5 佛山地区烟粉虱ToCV 带毒情况

3 结论与讨论

历经6 年田间调查，郑慧新（2021）总结了我国田间烟粉虱隐种的动态变化规律：MED 隐种持续作为田间优势种群分布于全国各地区，MEAM1隐种零星分布在沿海、云贵高原地区。肖思（2019）研究发现，2017 年在广东广州甘蓝寄主上采集的烟粉虱为MEAM1 隐种，占比达100%；2018 年在广东广州黄瓜、茄子寄主上采集的烟粉虱均为MEAM1、MED 混合种群，且在茄子上MED 隐种占比达60%。本试验对2021 年采集自佛山6 个地点的田间烟粉虱进行了隐种鉴定，结果显示三水区番茄寄主上的烟粉虱种群全部为MED 隐种；禅城区、南海区、顺德区均为MED、MEAM1 混合种群，且大部分地点MED 隐种占比大于MEAM1。可见，MED 隐种正在广东地区扩张传播，呈现出取代MEAM1 隐种成为广东地区主要优势种的趋势。

TYLCV 和ToCV 都是以烟粉虱为主要媒介进行传播，一般感染了TYLCV 的番茄将减产30%，严重的可减产50%，甚至绝收（赵统敏 等，2007；范丽娜 等，2021）。郑慧新（2021）调查显示：2015 年在我国29 个地区采集的14 个烟粉虱种群中只有2 个种群的TYLCV 带毒率为100%，而在2016 年采集的15 个烟粉虱种群中有14 个种群的TYLCV 带毒率达到了100%。短短1 年时间，TYLCV 就在我国大部分地区迅速传播蔓延。本试验结果显示，2021 年采集自佛山地区的田间烟粉虱样本除南海区狮山镇石门中学茄子寄主上烟粉虱种群TYLCV 带毒率为40%外，其他地点带毒率均大于50%。田间症状为：番茄叶片边缘均出现不同程度的上卷，部分植株出现矮化、果实着色不均匀。

回望2013—2016 年间全国烟粉虱ToCV 的带毒情况（郑慧新，2021）：2013 年采集的15 个烟粉虱种群中，仅5 个携带ToCV，且带毒率最高只有16.67%；2014 年这些种群带毒率普遍上升，超过50%；2015 年这些种群带毒率已远超90%。可见，ToCV 正在我国快速扩散。2014—2015 年间广东广州地区烟粉虱ToCV 的带毒率均为0（郑慧新，2021），而本试验中2021 年广东佛山地区烟粉虱种群的ToCV 带毒率均大于50%，且在调查的6 个地点中有5 个地点带毒率达到了100%。田间采样时，部分地点的作物正值苗期，植株染病症状并不明显；开花、结果期时笔者再次调查发现，植株表现出严重的褪绿黄化、叶片干枯脱落等症状。可见，ToCV 在苗期的隐匿性极强，造成田间防治的困难。实时监测烟粉虱种群ToCV 的带毒率，或能在一定程度上探知植株ToCV 的染病情况，帮助农民及早做出相应的防控措施，降低经济损失。

综合分析佛山地区田间烟粉虱的隐种分布及带毒率情况，发现烟粉虱MED 隐种占比高的地点TYLCV 的带毒率也相对较高。这可能是因为烟粉虱MED 隐种获毒、持毒、传毒能力都明显高于MEAM1（Ning et al.，2015）。此外，有研究发现，携带TYLCV 的烟粉虱MED 隐种在存活时间和产卵量上都高于MEAM1 隐种，并且发现获毒后MED 隐种的环境适应性得到提高，而MEAM1隐种的环境适应性下降（Rubinstein &Czosnek，1997；Matsuura &Hoshino，2009；Pan et al.，2012）。因此，推测烟粉虱携带的不同植物病毒在某种程度上也影响了田间烟粉虱隐种的分布。

综上所述，广东省佛山地区目前主要以烟粉虱MED、MEAM1 种群混合发生，由烟粉虱传播的TYLCV 和ToCV 已呈暴发流行趋势。今后需对佛山地区田间烟粉虱携带的TYLCV 和ToCV 进行更加全面的监测，为有效防控TYLCV 和ToCV 的流行和传播提供科学指导。