卵母细胞分泌因子在卵巢储备功能减退患者中的表达及对胚胎发育的影响

程立立，刘少华，刘 珊，许鹏宇，李冬秀，刘松娜，齐丽丽

1.河北医科大学第三医院生殖医学科,河北石家庄 050000；2.邢台医学高等专科学校第一附属医院妇产科， 河北邢台 054000；3.中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院生殖医学中心,河北石家庄 050000

目前，晚婚晚育已成为社会常态，特别是我国生育政策放开后，高龄夫妇要求再生育的比例明显增加，不孕症的发生率更高[1]。高龄女性卵巢储备功能下降，需要借助辅助生殖技术实现妊娠，但是其取卵数及可利用胚胎数大大减少，临床妊娠率较低[2]。如何改善高龄不孕女性助孕治疗结局是目前临床研究的热点。对于卵巢低储备功能患者主要以促性腺激素释放激素拮抗剂 (GnRH-A)方案、微刺激方案及高孕激素状态下促排卵(PPOS)方案为主要促排卵方案，但哪种方案效果更优仍存在争议，而且从卵母细胞成熟度方面对这3种方案进行比较，国内外鲜有研究。因此，本研究通过分析卵母细胞分泌因子在卵丘颗粒细胞(CCs)中的表达情况，预测不同的促排卵方案对卵母细胞成熟度及胚胎发育潜能的影响，为高龄不孕女性寻找更有效的促排卵方案，实现获卵最大化及寻找胚胎移植机会提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019 年1月至2021 年10月于中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院生殖医学中心行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)助孕治疗的高龄(本研究定义为年龄≥38岁)DOR患者为研究对象。纳入标准：(1)年龄≥38 岁；(2)符合卵巢低反应的标准[3]，①抗苗勒氏管激素(AMH)为0.5～1.1 ng/mL或者促卵泡激素(FSH)/促黄体生成素(LH)>3.6；②双侧卵巢窦卵泡数(AFC)5～7个；③既往有卵巢储备功能减退(DOR)或卵巢早衰(POF)病史，常规刺激方案获卵数≤3个。满足以上3 项中任意2 项即为DOR。排除标准：(1)夫妇双方或一方存在染色体异常；(2)合并各种内分泌代谢疾病，如甲状腺功能亢进症或甲状腺功能减退症、糖尿病、高泌乳素血症、多囊卵巢综合征等。本研究共纳入80例患者425份CCs。

1.2促排卵方法

1.2.1分组 根据促排卵方案，随机分为PPOS方案组(20 例89份CCs)、GnRH-A方案组(30例165份CCs)及微刺激方案组(30例171份CCs)。另外根据卵母细胞成熟情况，将卵母细胞分为GV期、MⅠ期及MⅡ期，MⅡ期根据受精情况分为正常受精组及异常受精组；正常受精组继续培养至第3日，根据胚胎情况分为优质胚胎组及非优质胚胎组；非优质卵裂胚继续培养至第5日或第6日囊胚期，分为优质囊胚组及非优质囊胚组。

1.2.2促排卵方案 微刺激方案：月经第2天或第3天开始给予来曲唑(LE，江苏恒瑞医药集团有限公司)2.5 mg/d或氯米芬(CC) 100 mg/d口服，同时给予注射用尿促性素(HMG，广州丽珠集团股份有限公司)，起始剂量为75～150 IU/d，5 d后停用LE或CC，根据患者卵泡大小和激素水平来调整促性腺激素(Gn)剂量，当卵泡直径为12～14 mm或血清LH水平>5 IU/L,皮下注射醋酸西曲瑞克(思则凯，默克雪兰诺有限公司，瑞士)0.25 mg,每天1次,直至注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)日。

GnRH-A方案：于月经第2天或第3天开始，给予注射用重组人促卵泡素(果纳芬，默克雪兰诺有限公司，瑞士)，起始剂量为150～300 IU/d，根据卵泡大小及激素水平适时调整Gn剂量，当卵泡直径为12～14 mm，和(或)雌二醇(E2)水平超过400 pg/mL，和(或)LH>5 IU/L时，加用醋酸西曲瑞克(思则凯，默克雪兰诺有限公司，瑞士)0.25 mg/d，直至注射HCG日。

PPOS方案组：月经第2～3天，B超提示卵泡直径≤7 mm，开始使用地屈孕酮(达芙通，雅培制药有限公司，美国)20 mg/d，同时应用HMG(广州丽珠集团股份有限公司)150～300 IU/d，根据患者激素水平及卵泡发育情况来调整Gn剂量，直至注射HCG日。

当双侧卵巢中直径≥18 mm的卵泡数是直径≥14 mm的卵泡数的60%～70%,每个卵泡的平均E2水平为200～300 pg/mL时进行扳机,于扳机后36～38 h进行经阴道B超引导下取卵术。

1.2.3观察指标 取卵后4～6 h采用机械法剥离单个卵子周围的CCs，使卵母细胞与单卵丘颗粒细胞群一一对应。观察GV、MⅠ、MⅡ期卵母细胞中生长分化因子-9(GDF-9)、骨形成蛋白-15(BMP-15)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的相对表达量；所有的成熟卵母细胞均采用ICSI授精，并连续观察受精、卵裂及囊胚形成情况。2PN为正常受精，其余为异常受精 。本中心优质胚胎的评分标准[4]：卵裂球7～9 个、排列规则、碎片≤20%。Gardner囊胚评分系统标准：≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚为优质囊胚。

1.3卵母细胞分泌因子检测方法

1.3.1CCs中RNA提取及反转录反应 GDF-9、BMP-15和TGF-β1的mRNA提取方法按照Trizol进行。提取的RNA采用琼脂糖凝胶电泳判定是否合格，然后按照反转录反应试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司)说明书进行反转录,反应条件如下：70 ℃ 10 min,42 ℃50 min,95 ℃5 min。

1.3.2实时荧光定量聚合酶链反应 GDF-9、BMP-15和TGF-β1的mRNA表达量检测，按照 QuantiFast®SYBR®Green 试剂盒(德国Qiagen Rotor-Gene Q)说明书进行检测并收集数据：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s,60 ℃退火/延伸30 s,共40个循环。将所得的Ct值按照公式2ΔCt进行计算。

2 结 果

2.13组患者基线资料比较 3组患者年龄、不孕年限及卵巢功能指标等基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。GnRH-A方案组采用Gn天数及Gn剂量明显多于微刺激方案组和PPOS方案组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组患者基线资料比较

组别nbLH(mIU/mL)bE2(pg/mL)采用Gn天数(d)Gn剂量(IU)微刺激方案组304.99±1.1361.77±13.889.55±0.892077.50±153.23PPOS方案组204.62±0.7871.29±17.209.50±1.052061.25±152.06GnRH-A方案组304.64±1.0370.03±18.9010.16±0.91ab2232.50±168.94abP0.4190.1570.024<0.001

2.2总RNA检测 琼脂糖凝胶电泳检测RNA结果显示，提取的RNA完整性及纯度均较高，符合实验条件，见图1。

注：1、2泳道为成熟卵母细胞RNA;3、4泳道为未成熟卵母细胞RNA。

2.3聚合酶链反应产物凝胶电泳检测结果 聚合酶链反应产物通过电泳检测验证可见电泳条带清晰单一，见图2。

2.4微刺激方案组中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量 在微刺激促排卵方案组中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于MⅠ期，差异有统计学意义(P=0.037、P=0.046、P<0.001)； MⅠ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于GV期，差异有统计学意义(P=0.046、P<0.001、P=0.035)；正常受精组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于异常受精组，差异有统计学意义(P=0.001、P=0.012、P=0.048)；优质胚胎组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量均明显高于非优质胚胎组，差异有统计学意义(P=0.007、P=0.015、P=0.003)；优质囊胚组GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于非优质囊胚组，差异有统计学意义 (P=0.048、P=0.040、P=0.037)。见表2。

注：1～5泳道分别为100 bp DNA ladder、TGF-β1、核糖体蛋白L/P(RDL-19)、BMP-15、GDF-9。

表2 微刺激方案组中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量

2.5GnRH-A方案组中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量 在GnRH-A方案组中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于MⅠ期，差异有统计学意义(P=0.029、P=0.025、P=0.049)，MⅠ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于GV期，差异有统计学意义(P=0.014、P=0.038、P=0.043)；正常受精组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于异常受精组，差异有统计学意义(P=0.036、P=0.034、P=0.044)；优质胚胎组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于非优质胚胎组，差异有统计学意义(P=0.014、P=0.002、P<0.001)；优质囊胚组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于非优质囊胚组，差异有统计学意义(P=0.029、P=0.049、P=0.045)。见表3。

表3 GnRH-A方案组中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量

2.6PPOS方案组中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量 在PPOS方案组中，MⅡ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于MⅠ期，差异有统计学意义(P=0.016、P=0.049、P=0.023)，MⅠ期的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于GV期，差异有统计学意义(P=0.026、P=0.044、P=0.044)；正常受精组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于异常受精组，差异有统计学意义(P=0.028、P=0.024、P=0.036)；优质胚胎组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于非优质胚胎组，差异有统计学意义(P=0.026、P=0.040、P<0.001)；优质囊胚组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于非优质囊胚组，差异有统计学意义(P=0.016、P=0.037、P=0.039)。见表4。

表4 PPOS方案组中GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量

2.73组在卵母细胞阶段GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量比较 GnRH-A方案组GDF-9、BMP-15相对表达量明显高于微刺激方案组、PPOS方案组，差异有统计学意义(P<0.05)；微刺激方案组BMP-15相对表达量明显低于PPOS方案组，差异有统计学意义(P<0.05)；其余各组间GDF-9、BMP-15、TGF-β1相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 3组在卵母细胞阶段GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量比较

3 讨 论

DOR是一种以卵巢内可募集的AFC减少和(或)卵母细胞质量下降，导致配子生成功能下降，生育力低下的生殖内分泌疾病[5]。DOR病因众多，即使经过全面评估，病因仍不明确，主要与遗传、年龄、自身免疫性疾病、感染性疾病、社会环境及心理等多种因素有关[6]。辅助生殖技术是DOR患者在有限的时间内尽快实现生育的重要辅助治疗手段，在生殖医学领域备受关注。目前,如何更有效地预测胚胎的发育潜能，为DOR患者选择个体化的促排卵方案，在最短的时间内最大限度增加获卵数及优质胚胎数是生殖医学领域迫切需要解决的难题之一。

CCs紧紧包绕在卵母细胞周围，与卵母细胞关系最为紧密，对卵母细胞的生长、发育、成熟、受精发挥至关重要的作用。CCs和卵母细胞通过缝隙连接进行双向交换，CCs为卵母细胞成熟及发育提供必需的营养物质，促进卵母细胞成熟、排卵及随后的胚胎发育，提高卵母细胞质量。同时卵母细胞调控CCs的细胞外基质合成及细胞分化，并积极调节CCs的功能，从而控制复杂的CCs微环境。CCs基因的表达谱因卵母细胞成熟的阶段不同而不同。

本研究选取CCs作为研究载体，可以使CCs与卵母细胞一一对应，较壁层颗粒细胞及卵泡液有更高的同源性、特异性及较低的污染率[7-8]，研究结果更加精确。本研究首次对高龄患者的单卵丘颗粒细胞群进行研究，采用实时荧光定量聚合酶链反应来定量检测卵母细胞分泌因子GDF-9、BMP-15及TGF-β1 的相对表达量。

卵母细胞的发育潜能包括恢复第1次减数分裂；受精后能够正常卵裂；能够发育至囊胚期；能足月活产；子代健康[9]。卵母细胞成熟度包含卵母细胞核成熟和细胞质成熟，只有细胞质和细胞核同步成熟，卵母细胞才能成熟，并完成受精及后续的胚胎发育[10]。

本研究对高龄患者的胚胎从卵母细胞到囊胚形成阶段进行连续性研究，且能做到和单卵丘颗粒细胞群一一对应进行观察及检测，使结果更客观、更精确，从而为胚胎学医生选择优质卵母细胞提供更有价值的参考，更好地预测卵母细胞的发育潜能。

本课题组最近一项研究显示，在年龄<35岁患者中，卵母细胞分泌因子可作为评价卵母细胞质量、预测卵母细胞发育潜能的客观指标[11]。但是卵母细胞分泌因子在高龄患者中的相对表达量，以及其对卵母细胞成熟度及其胚胎发育潜能的连续性研究鲜有报道。

本研究结果显示，在3种促排卵方案中，MⅡ期GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量高于MⅠ期和GV期；正常受精组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量高于异常受精组(P<0.05)；优质胚胎组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量高于非优质胚胎组(P<0.05)；优质囊胚组的GDF-9、BMP-15和TGF-β1相对表达量明显高于非优质囊胚组(P<0.05)。由此可以看出，上述3 种卵母细胞分泌因子可作为高龄DOR患者评估卵母细胞质量、预测卵母细胞发育潜能的客观指标。

随着国家生育政策的实施，尤其是“三孩”政策的放开，高龄生育人群越来越多，DOR患者在生育人群中所占的比例也越来越高，其在辅助生殖过程中，存在Gn用量大，药物反应差，获卵少，胚胎质量差等问题[12]。虽然各种促排卵方案均可用于DOR患者，但是对于DOR患者人群而言，需要减少促排卵时间、提高胚胎质量，增加优质胚胎数，在最短的时间实现活产。降调节方案可能导致卵巢过度抑制，致使促排时间长，Gn用量大、花费较高、再次取卵等待时间长等问题。GnRH-A方案和微刺激方案虽然解决了卵巢过度抑制的问题，且卵巢过度刺激综合征的发生率低，但微刺激方案早发LH峰导致的周期取消率高，新鲜周期移植率低，取卵周期次数增加，同时早期LH升高还可能会影响卵子质量[13],使可利用胚胎数减少，延长妊娠时间；GnRH-A方案可以迅速抑制LH升高的问题，防止卵泡提早黄素化或排卵，降低周期取消率，但DOR患者更易引发突发LH峰，同时伴有E2水平降低，易造成非预期的排卵，使周期取消率增加，需要及时识别突发的LH峰，及早处理。同时，拮抗剂的添加可导致FSH及LH的迅速下降，致使卵泡发育变慢，雌激素水平下降，可能增加Gn用量和采用Gn天数，使周期花费稍微增高。PPOS方案能够有效预防早发LH峰，降低周期取消率，而且具有Gn周期短、费用低、用药方便等优点,近年来被广泛应用于DOR患者。沈秀等[14]将PPOS方案应用于FSH升高的DOR患者，结果发现其能有效抑制LH峰，提高优质胚胎率。最近的研究也表明，PPOS方案较超短方案及微刺激方案，能够有效抑制早发LH峰，而且卵泡数量、卵子质量、可利用胚胎数及优质胚胎数更多[15-16]。但PPOS方案使卵泡在发育过程中始终处于高孕激素状态,过早使孕酮作用于子宫内膜，导致胚胎发育和子宫内膜容受性之间的同步中断,影响卵泡与子宫内膜的同步化,需要全胚冷冻和延迟移植[17-18]。因此，寻找合适的促排卵方案，尽快获取高质量的卵子和优质胚胎是改善DOR患者辅助生殖临床结局的关键。

本研究分析了高龄不孕患者的卵母细胞分泌因子相对表达量，且在不同促排卵方案之间进行比较，以期找到更适合高龄DOR患者的促排卵方案。本研究按促排卵方案分为微刺激方案组、GnRH-A方案组和PPOS方案组。TGF-β1的相对表达量在不同促排卵方案组中比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而GDF-9及BMP-15在不同促排卵方案组中比较，差异有统计学意义(P<0.05)。但GnRH-A方案组采用Gn天数及Gn剂量明显多于其余两组(P<0.05)。笔者认为不同的促排卵方案可能影响卵母细胞分泌因子的表达情况，从而影响卵母细胞的成熟度及其后续胚胎的发育潜能，与妊娠结局密切相关。

本研究的不足之处：样本量较少，分析结果可能存在一定的偏倚，还需要开展大样本、多中心研究；本研究因大多数患者未进行胚胎移植，因此未进行临床妊娠结局的比较，在以后的临床工作中，本课题组会继续跟踪观察这些患者的妊娠情况；目前，这3种方案对于年龄<35岁，卵巢储备功能正常患者的应用也越来越普遍，因本中心对于卵巢储备功能正常的患者应用PPOS方案较晚，本研究未与年龄较小、卵巢储备功能正常的患者进行比较，后续本课题组会进行深入研究。

综上所述，卵母细胞分泌因子 GDF-9、BMP-15和TGF-β1的相对表达量可以作为评价卵母细胞成熟度和发育潜能的客观指标，为高龄患者提高妊娠率提供理论基础。对于DOR患者，GnRH-A方案可以有效抑制LH峰，降低周期取消率，但Gn用量增加，周期花费较高；微刺激方案采用Gn天数更少、Gn用量低，对卵巢刺激小，但易出现早发LH峰，周期取消率高；PPOS方案能有效抑制LH峰，Gn用量少、花费较少，但因孕激素过早作用于子宫内膜，使卵泡发育和子宫内膜发育不同步，不能行新鲜周期移植，需行全胚冷冻。因此，临床可根据DOR患者具体情况进行个体化的治疗，选择更合适的方案。