弥漫大B细胞淋巴瘤CD68和CD34表达情况及临床价值

王雪莲，孙丽华

复旦大学附属中山医院青浦分院血液科，上海 201700

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤，是一组在遗传学、病理特征、免疫表型和临床表现及治疗反应上均具有高度异质性的侵袭性血液肿瘤[1]。DLBCL的影响因素包括遗传分子生物学、生活方式、家族史、药物、免疫紊乱和职业等，DLBCL还具有不同的组织学特征，易在疾病早期发生远处扩散。利妥昔单抗与环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松的联合使用(R-CHOP方案)是目前治疗DLBCL的标准治疗方案。尽管使用了R-CHOP方案进行治疗，仍有许多DLBCL患者出现早期复发，甚至死亡[2]。近年来，随着医疗技术的不断发展，肿瘤微环境(TME)在DLBCL中的作用机制及其对预后判断的价值已成为最新的研究热点。TME是基于肿瘤细胞与基质成分、细胞外基质、炎症细胞和免疫细胞之间的相互作用，并在这个相互作用中表现出组成空间特征的显著异质性[3]。肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 作为TME的重要组成部分，在肿瘤发生、发展中发挥着重要作用，其中CD68是TAM的特征性标志物之一。有研究发现，套细胞淋巴瘤中CD68阳性巨噬细胞计数升高与预后不良有关[4]。CD34是常用的血管内皮标志物，TAMMA等[5]通过对滤泡性淋巴瘤的研究发现，CD34阳性的微血管不仅数量较多，而且CD34阳性的微血管数量与CD68阳性和CD163阳性巨噬细胞计数呈正相关，提示该类型巨噬细胞亚群具有重要血管生成潜力，微血管密度(MVD)升高者预后较差。所以，寻找有效的生物标志物来判断DLBCL的预后就显得非常重要。本研究应用免疫组化(SP)法检测DLBCL中CD68和CD34的表达，并分析二者判断DLBCL预后的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2016年5月至2019年5月本院诊断为DLBCL的67例患者资料。纳入标准：(1)符合2008年世界卫生组织(WHO)制订的淋巴造血组织肿瘤分类标准；(2)经病理检查确诊，且为初次诊断；(3)确诊后正常治疗；(4)患者的生存期大于3个月以上。排除标准：(1)合并代谢性疾病及严重心、肝、肺、肾功能障碍的患者；(2)有自身免疫性疾病病史的患者；(3)既往有恶性肿瘤病史患者；(4)由惰性淋巴瘤进展为DLBCL的患者。所有患者均签署知情同意书，本研究已通过本院医学伦理委员会批准。

1.2方法 采用SP法检测CD68和CD34在DLBCL中的表达情况。手术切除肿瘤组织，石蜡切块、脱蜡、水化、烤片，浸于二甲苯5 min，并采用100%、95%、90%、85%和75%乙醇梯度处理，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，阻断内源性过氧化物酶，再进行抗原修复，分别滴加稀释CD68单克隆抗体和鼠抗人CD34 单克隆抗体一抗，4 ℃条件下过夜，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，加辣根酶标记链霉卵白素，PBS冲洗，增敏二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染5 min，充分水洗，分化，返蓝，乙醇梯度，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜观察并拍照。

1.3结果判断 CD68阳性判断标准：随机选取5个高倍视野，与背景着色相对比，对染色强度进行评分，无色记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。对阳性细胞所占的百分比进行评分，阴性记0分，阳性细胞<10%记1分，阳性细胞为10%～<30%记2分，阳性细胞为30%～<50%记3分，阳性细胞为50%～<75%记4分，阳性细胞≥75%记5分。最后得分为染色强度与阳性细胞百分比分数之和，0～1分为CD68阴性表达，2～8分为CD68阳性表达。CD34标记的MVD判定：采用MVD计数方法，在低倍镜下选择3个密度最高的微血管区域，计算CD34所染成棕色的微血管数量，所得平均值则为MVD。

1.4随访 随访时间从疾病确诊开始，截止时间为2022年5月31日，随访内容包括患者的一般情况、治疗和近期复查情况，方式为查阅电子版和纸质版病历。另以电话的形式随访患者的3年总生存率(OS)和无进展生存率(PFS)，OS的计算是从DLBCL的确诊到肿瘤本身引起的死亡，或随访满3年终止；PFS的计算是从DLBCL的确诊到肿瘤复发、转移或病情恶化。

1.5统计学处理 采用 SPSS20.0统计软件进行数据处理及统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。生存曲线分析采用Kaplan-Meier法，组间生存期的比较采用Log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CD68和CD34的总体表达情况 67例DLBCL患者中，40例CD68表达为阳性，阳性率为59.7%，染色的细胞膜有棕黄色颗粒，并呈现多角形、扩张状和闭塞的条索状等不规则状态；35例CD34表达为阳性，阳性率为52.2%，细胞膜或者细胞质呈棕褐色或者棕黄色，形态清晰。见图1。

注：A为CD68阳性表达；B为CD68阴性表达；C为 CD34阳性表达；D为CD34阴性表达。

2.2不同特征DLBCL患者的CD68和CD34表达情况比较 不同年龄、性别、原发部位、B症状出现情况[淋巴瘤患者出现以下任意一项症状者：原因不明的发热(通常38 ℃以上)、盗汗、原因不明的体质量减轻10%以上]、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平的DLBCL患者CD68及CD34阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；Ann Arbor临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、国际预后指数(IPI)评分为3～4分、有骨髓侵犯DLBCL患者的CD68及CD34阳性率明显高于Ann Arbor临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、IPI评分为0～2分、无骨髓侵犯DLBCL患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34表达情况比较[(n)%]

2.3不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表达情况比较 不同年龄、性别、原发部位、B症状出现情况、血清LDH水平DLBCL患者的CD68和CD34共同表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；Ann Arbor临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、IPI 评分为3～4分、有骨髓侵犯的DLBCL患者CD68和CD34共同表达率明显高于Ann Arbor临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、IPI评分为0～2分、无骨髓侵犯DLBCL患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4CD68和CD34表达对DLBCL患者生存预后的影响 67例DLBCL患者中，共有4例患者失访，失访率为6.0%。CD68阳性患者的3年OS和PFS分别为52.5%和45.0%，CD68阴性患者的3年OS和PFS分别为77.7%和70.4%，CD68阳性患者的3年OS和PFS均低于CD68阴性患者，差异有统计学意义(P=0.047、0.044)；CD34阳性患者的3年OS和PFS分别为51.4%和42.9%，而CD34阴性患者的3年OS和PFS为75.0%和68.8%，CD34阳性患者的3年OS和PFS也低于CD34阴性患者，差异有统计学意义(P=0.030、0.013)。见图2～5。

表2 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表达情况比较[(n)%]

续表2 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表达情况比较[(n)%]

图2 CD68阳性与阴性患者的3年OS生存曲线比较

图3 CD68阳性与阴性患者的3年PFS生存曲线比较

图4 CD34阳性与阴性患者的3年OS生存曲线比较

图5 CD34阳性与阴性患者的3年PFS生存曲线比较

3 讨 论

DLBCL占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，临床上常表现为单个或多个、淋巴结内或淋巴结外快速增长的肿块。目前DLBCL的发病率呈逐年上升趋势，即使患者使用包括R-CHOP方案在内的多种不同方案进行治疗，患者5年生存情况也不理想，因此，寻找新的治疗方法迫在眉睫[2]。另外，由于DLBCL在免疫表型、细胞形态和临床特征等方面均具有明显的异质性，所以不同的亚型、不同的个体间在治疗效果、临床特点和预后方面存在明显差异。目前，针对免疫检查点、TME、分子信号通路和表观遗传畸变的疗法，以及细胞免疫疗法共同构成了DLBCL治疗的新格局[6]。所以，准确和有效地识别危险度不同的患者就显得非常重要，特别是对于高危患者，早期诊断有助于采取积极有效的治疗措施，对改善患者的预后具有重要的意义。目前，随着分子生物学技术及免疫治疗技术的发展，TME中的某些相关因子在DLBCL中的表达及其临床意义逐渐受到重视。在TME中，TAM不仅能够促进TME中的炎症反应，还可以产生细胞外基质调节因子和促血管生长因子，刺激肿瘤的生长[7]。 CD68是巨噬细胞通用型标志物，有研究表明CD68的表达可以评估TME中TAM水平，在某些DLBCL中CD68的高表达提示预后不良[8]。LI等[9]通过对DLBCL的研究发现，CD68高表达患者的OS和PSF均低于CD68低表达患者,此外，还可以通过检测CD68的表达进一步识别高危患者，尤其是那些被IPI归类为低/中危的患者。

同时，血管为肿瘤生长提供营养和氧气支持，为脏器转移提供特殊通道，肿瘤血管密度越高则越利于癌细胞生长，肿瘤的侵袭性越强。而CD34作为公认的血管内皮标志物，存在于内皮依赖性血管的细胞上，CD34表达与血管生成有关，在肿瘤新生血管的内皮细胞中高表达，在正常组织的血管内皮细胞中不表达或者低表达。采用CD34抗体进行SP染色观察肿瘤MVD，可以有效反映肿瘤的血管生成。血管内皮生长因子(VEGF)能够促进血管内皮细胞的生长，诱导TME中微血管的生成，促进DLBCL的发生及进展。TAMMA等[10]在另一项针对黏膜相关淋巴瘤的研究中发现，MVD和M2型巨噬细胞呈正相关，该结论可为开发新的免疫治疗策略提供积极帮助。

本研究采用67例DLBCL患者作为研究对象，研究结果显示：40例CD68表达为阳性，阳性率为59.7%，35例CD34表达为阳性，阳性率为52.2%，CD68和CD34的阳性率均达到50.0%以上；同时比较了不同特征患者CD68、CD34的表达情况，结果发现，Ann Arbor临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、IPI评分为3～4分、有骨髓侵犯DLBCL患者的CD68及CD34阳性率明显高于Ann Arbor临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、IPI评分为0～2分、无骨髓侵犯DLBCL患者(P<0.05)。本研究进一步分析了CD68和CD34表达对DLBCL患者生存预后的影响，结果显示，CD68阳性和CD34阳性患者的3年OS和PFS分别低于CD68阴性和CD34阴性患者，提示TAM与DLBCL的预后有关。TAM的成分及成分之间的相互作用与患者的预后密切相关，TAM能够更好地区分预后较差的患者，并为下一步治疗提供一个新的方向[3]。

综上所述，CD68和CD34阳性表达与DLBCL患者的Ann Arbor临床分期、IPI 评分、骨髓侵犯及生存预后具有一定的关系，且CD68和CD34阳性DLBCL患者预后不良。