肝郁对围绝经期综合征大鼠认知功能及脑组织氧化应激的影响

沈建英，梁文娜，张凌媛，丁珊珊，康 洁，赵 田，陈 燕，刘圣洋，杨 敏，龚 琳

（1.福建中医药大学中医证研究基地，福建 福州 350122；2.福建省中医健康状态辨识重点实验室，福建 福州 350122）

女性患抑郁症的比例大约是男性的2 倍［1］，到了围绝经期甚至高达5 倍［2］。女性进入围绝经期后容易出现抑郁、焦虑及健忘等情志异常的表现。前期研究表明，肝气郁结是围绝经期综合征的主要病理过程之一［3-4］。肝失疏泄是导致脑老化的重要因素之一［5-6］，可以通过调补肝气及疏肝解郁调节机体氧化失衡状态或提升端粒酶活性［6-7］，改善学习认知功能，从而延缓衰老进程。近年来关于应激加速衰老的研究逐渐受到越来越多学者的关注［8］。然而，目前大多数研究仍使用雄性动物作为研究对象［9-10］，而对雌性动物尤其是围绝经期大鼠的报道相对较少。因此，本研究采用慢性束缚应激联合孤养法建立围绝经期综合征大鼠肝郁模型，利用水迷宫实验来检测学习记忆能力，评价其抗氧化应激能力，从而进一步阐明围绝经期综合征肝郁对脑衰老进程的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 9 月龄健康SPF 级雌性SD 大鼠32 只，体质量（430±30）g，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。所有动物饲养于福建中医药大学实验动物中心，动物房温度控制在（22±2）℃，相对湿度55%～70%，采用8AM/8PM 交替的12 h 照明方式，自由摄食和饮水，正常饲养至12 月龄。

1.2 实验试剂 促肾上腺皮质激素（adrenocor ticotropic hormore，ACTH）、皮质酮（corticostrone，CORT）试剂盒（美国CUSABIO 公司，货号：CSB-E06875r、CSB-E07014r）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A001-3、A003-1）；BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司，货号：P0012S）；冰乙酸（西陇化工股份有限公司，货号：1270570201600）；95%乙醇（国药-沪试，货号：10009164）。

1.3 实验仪器 SMG-2 型Morris 水迷宫（北京医学科学院药研所）；infinite M200 Pro 型连续波长多功能酶标仪（奥地利Tecan 公司）；5810R 型离心机（德国Eppendorf 公司）。

2 实验方法

2.1 造模 采用慢性束缚应激结合孤养法建立围绝经期综合征肝郁大鼠模型。造模期间，对大鼠进行孤养，束缚应激时间为6 h（约9：00—15：00），连续束缚42 d。束缚造模具体方法如下，将大鼠置于特制的束缚筒内，束缚器呈管状，长约20 cm，筒口内径7.0 cm，前端为通气孔，尾端为可关闭的盖子。管壁有若干通气孔，使大鼠能够自由呼吸与排泄。采用旷场实验和糖水偏好实验来观察大鼠焦虑样及抑郁样行为的改变，并结合体征变化筛选出旷场实验水平得分、垂直得分及糖水消耗率明显下降的大鼠，视为造模成功［11］。

2.2 分组 造模前连续10 d 观察雌性SD 大鼠动情周期，筛选出动情周期紊乱的36 只围绝经期综合征大鼠，同时利用旷场实验对每只大鼠进行行为学评分，水平运动和垂直运动总得分＜30 分和＞150 分的大鼠予以剔除，选择各项行为学指标得分相近的围绝经期综合征大鼠32 只，采用随机数字表法按体质量分层将大鼠分为对照组（n＝12）和模型组（n＝20）。模型组按“2.1”项下造模方法建立围绝经期综合征肝郁大鼠模型，对照组以每笼4 只进行群养，除造模及行为测试时段所有动物给予自由进食与饮水。最后造模组筛选出成模大鼠12 只。

2.3 ACTH 及CORT 含量检测 于造模结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，依次用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，用EDTA 抗凝剂的采血管收集血液，室温静置30 min，于4 ℃下3 000 r/min 离心10 min，分装后置于-80 ℃冰箱保存。ACTH 及CORT 含量测定按试剂盒说明书操作步骤进行。

2.4 水迷宫实验 分别于造模前5 d和造模第37天上午9：00—11：00 对2 组大鼠进行Morris 水迷宫测试。水迷宫被平均分为4 个象限，站台置于第3 象限。实验分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验历时共4 d，每天训练4 次，第1 天将大鼠面向池壁从第1 象限的中点处入水，第2 天从第2 象限的中点处入水，以此类推。观察并记录大鼠在60 s 内寻找水下平台的时间，即逃避潜伏期，若60 s 内仍未找到平台，逃避潜伏期记为60 s，并将动物引导到平台上熟悉环境并休息10 s，再进行下一次测试，分别计算每天逃避潜伏期的平均值。空间探索实验历时1 d，于第5 天进行，撤除水下平台后，将大鼠面向池壁从第1 象限的中点处入水，记录其在60 s 内第3 象限的活动时间及穿越原平台所在位置的次数。

2.5 脑组织SOD、MDA 含量测定 腹主动脉取血后立即断头，快速将分离下来的全脑组织置于冰盘上，迅速切除前额叶皮质并剥取海马，将组织用冻存管收集，称重结束后立即置于液氮中速冻，-80 ℃保存备用。采用黄嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥酸法检测SOD 和MDA 含量，按试剂盒说明书操作步骤进行。

2.6 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用独立样本t检验；组内不同时间点比较采用重复测量方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 2 组大鼠体征及血浆中ACTH 和CORT 含量比较 造模前，2 组大鼠皮毛色泽光亮，精神状况良好，活动反应灵敏。造模后，对照组大鼠体征无明显变化，模型组大鼠则表现出食欲下降、粪便稀软、反应迟钝、精神萎靡、焦躁不安、偶有嘶叫等现象。同时，模型组大鼠血浆的ACTH 和CORT 含量较对照组均明显升高（P＜0.01），见图1。

图1 2 组大鼠血浆ACTH 和CORT 含量比较

3.2 2 组大鼠糖水消耗率和矿场实验得分比较 与对照组比较，模型组大鼠造模后糖水消耗率明显下降（P＜0.01），旷场实验水平和垂直得分也明显下降（P＜0.01）。见图2、图3。

图2 2 组大鼠糖水消耗率比较

3.3 2 组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期比较 在基线水平，随着训练次数的增加，模型组大鼠的平均逃避潜伏期逐渐缩短。造模结束后，模型组的平均逃避潜伏期较对照组显著延长（P＜0.01），见图4。

图3 2 组大鼠旷场实验水平和垂直得分比较

图4 2 组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期比较

3.4 2 组大鼠空间探索实验中在第3 象限的平均停留时间比较 造模结束后，与对照组比较，模型组大鼠空间探索实验中在第3 象限的平均停留时间明显缩短（P＜0.01），见图5。

图5 2 组大鼠空间探索实验中在第3 象限的平均停留时间比较

图6 2 组大鼠海马和前额叶皮质组织SOD 活 力 和MDA 含 量 比 较

3.5 2 组大鼠海马和前额叶皮质组织SOD 活力和MDA 含量比较 与对照组比较，模型组海马及前额叶皮质组织SOD活力明显下降（P＜0.01），MDA 含量明显上升（P＜0.01）。见图6。

4 讨 论

女子以肝为先天，肝功能失调、情志异常是加速机体衰老的重要原因之一［12］。本研究进一步探讨了肝郁对围绝经期综合征大鼠脑衰老进程的影响，结果表明，慢性束缚应激结合孤养法可以复制围绝经期综合征肝郁大鼠模型，对学习及空间记忆能力造成明显的损伤，海马和前额叶脑组织抗氧化应激能力显著下降。提示肝郁会在一定程度上加速围绝经期综合征大鼠脑衰老的进程，这也与国内学者提出“肝失疏泄致脑老化”的假说［5］及国外学者提出脑衰老的应激学说［13］相一致，从而进一步丰富了“因郁促衰”的相关理论假说。

慢性应激或糖皮质激素（glucocorticoid，GC）过高均会加速大脑的衰老进程，并最终导致脑损伤。皮质酮（CORT）是啮齿动物中最主要的GC，对海马神经元的伸长、分化及其生理功能有直接的影响。临床研究也发现，GC 含量高的患者记忆力受损明显［14］，MDD 患者常伴有认知障碍，其症状与AD 患者相似［15］。另外，长期注射GC 会损伤皮层及海马，导致海马体积减小［16］。水迷宫实验能较准确地反映大鼠的空间学习记忆能力，其中定位搜索实验是用来测试记忆保持能力，空间搜索实验用来测试空间学习能力。本研究发现，造模结束后模型组大鼠在定位航行实验中的平均逃避潜伏期显著延长，在第3 象限的平均停留时间显著缩短，提示肝郁对围绝经期综合征大鼠的学习及空间记忆能力造成比较明显的损害。BODNOFF 等［17］比较了皮质酮持续注射3 个月对不同月龄大鼠空间记忆力的影响，发现中年大鼠出现明显的空间记忆障碍，而青年大鼠则几乎不受影响，说明了随着年龄增长，HPA 轴持续亢进对中年大鼠的神经系统造成的损伤可能更为严重。但是，也有研究发现GC 的急性或短暂分泌能够促进学习过程，增强学习及空间记忆能力，对防止神经系统退化和衰老有积极的作用［18-19］。因此，应激时程或GC 注射持续时间的长短均可能会对大鼠空间学习记忆产生不同的影响，增龄及持续的慢性应激可能是肝郁导致围绝经期综合征大鼠空间记忆力下降的重要因素。

科学家们对脑老化的机制进行了许多推测，自由基学说占有一席之地，该学说认为机体代谢过程中产生的一些自由基会对细胞内生物大分子产生氧化损伤反应，损伤的累积可逐渐引起细胞功能的衰退，导致脑老化的发生。随年龄增长体内自由基水平随之增高，由其诱导产生的某些有害物质也增多，而对自由基的防御功能却逐渐下降。在增龄和慢性应激等损伤条件下，HPA 轴负反馈机制失调，机体的氧化和抗氧化防御系统失衡，自由基的产生大于清除，由其诱导产生的某些有害物质逐渐增多，就会造成脑内产生广泛的神经化学及形态学改变，最终导致大脑器质性损害，而与情绪、认知密切相关的边缘系统尤其是海马和前额叶皮质最容易受到影响［20-21］。长期慢性应激可能会导致中枢神经可塑性下降［22-23］，诱发大量自由基的产生，导致胞质内脂褐质增多，脑老化过程加速，从而出现认知功能障。SOD 具有明显的抗氧化作用，能有效地消除衰老的启动因子即超氧阴离子自由基，在保护脑功能、延缓衰老方面发挥着重要的作用。MDA是自由基损伤不饱和脂肪酸生成的过氧化终产物。也有类似的研究报道不同的慢性应激方式均可导致脑组织SOD活性明显下降，MDA含量显著升高［21，24］。本研究发现，模型组大鼠前额叶皮质及海马组织的SOD 活力均显著下降，MDA 含量显著升高，提示肝郁会导致围绝经期综合征SD 大鼠脑组织的抗氧化应激能力下降，侧面反映了肝郁可能会在围绝经期自然衰老的基础上进一步加速脑衰老的进程。因此，模型组大鼠海马及前额叶皮质抗氧化应激能力下降可能是导致围绝经期综合征大鼠认知功能障碍，促进脑组织衰老的重要原因之一。

综上所述，肝郁造模会导致围绝经期综合征大鼠认知行为及抗氧化应激能力显著下降，从行为学及自由基的层面说明了肝郁会加速围绝经期综合征SD 大鼠脑衰老的进程。该研究从实验角度提示长期慢性应激导致的肝郁可能严重影响着围绝经期女性的身心健康并加速机体衰老，进一步阐明慢性应激加速围绝经期综合征大鼠脑衰老的具体机制，将对临床延缓围绝经期女性脑衰老具有十分积极的指导意义。