八宝丹阻滞人结肠癌细胞周期抑制结肠癌细胞生长

方 翌，郭旭鸿，魏丽慧，朱 洁，沈阿灵，林久茂

（1. 福建中医药大学科技创新与转化中心，福建 福州 350122；2. 福建中医药大学附属第二人民医院&中西医结合研究院临床研究所，福建 福州 350122；3. 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；4. 福建中医药大学药学院，福建 福州350122；5. 福建中医药大学科学技术处，福建 福州 350122；6. 福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；7. 福建省高校中西医结合基础重点实验室，福建 福州 350122）

结直肠癌是一种常见的消化道恶性疾病，在世界范围内的发病率和致死率分别排第三和第二［1］。结肠癌患者常伴随着脏腑、组织、机体等方面的严重损伤，若在患病早期进行科学、有效地治疗，能在一定程度上提高患者的生存率［2］。近年来，随着恶性肿瘤的治疗理念发生变化，中药对癌症的防治效果日益明显，尤其是对癌症的转移、复发有较大的抑制作用，87%的肿瘤患者采用了中西医结合的治疗方案［3］。八宝丹（BBD）是我国传统中医方剂之一，其主要成分包括麝香、三七、蛇胆、牛黄、珍珠、羚羊角，具有清热凉血、清肝解毒、消肿止痛的功效。研究显示，八宝丹具有术后辅助肿瘤治疗的作用［4］，其抗肿瘤机制主要通过抑制肿瘤细胞生长［5］、调控肿瘤细胞周期［6］、诱导肿瘤细胞凋亡［7］等方面发挥作用。然而其在抗结肠癌的基础研究还尚少。因此，本课题通过体外实验，探究八宝丹对结肠癌细胞生长的影响，以期为结肠癌的防治进一步提供重要的实验依据。

1 实验材料

1.1 实验细胞与药物 人结肠癌细胞HCT116，购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，保存于液氮罐中。八宝丹购自厦门中药厂（批号：180901）。

1.2 实验试剂 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa 公司）；Trizol、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix、RNase Staining Solution（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）一抗和兔二抗（美国CST 公司，批号：E3P5S、D9G3E）Super ECL Star 特超敏化学发光检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；McCoy” s 5A 不完全培养液（江苏凯基生物技术股份有限公司）。

1.3 实验仪器 CFX96 touch（美国Bio-Rad 公司）；Countstar tigel 53 自动细胞计数仪（中国睿钰生物科技有限公司）；倒置显微镜（德国Leica 公司）；Multiskan FC 多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；流式细胞仪Facscelesta（美国BD 公司）。

2 实验方法

2.1 八宝丹药液配制 将BBD 药粒碾成粉末，溶解于PBS 溶液，配制成浓度为25 mg/mL 的母液，30 min 超声溶解，高压灭菌后分装于1.5 mL 的EP管，存于4 ℃冰箱备用。

2.2 分组及干预 用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的McCoy” s 5A不完全培养液培养细胞，实验设置4个分组（0 mg/mL组、0.5 mg/mL组、1 mg/mL组、2 mg/mL 组），按1×105个/mL 浓度分别接种于96 孔板和6 孔板中，贴壁过夜后以不同浓度BBD（0、0.5、1、2 mg/mL）干预24 h。

2.3 MTT 实验 待测细胞每孔加入100 μL 的1×MTT（9 mL PBS+1 mL MTT 溶液），培养箱中孵育4 h后去原液，加入100 μL DMSO，振荡2 min 后于450 nm 波长 处测定OD 值。

2.4 集落形成实验 将BBD 干预后的细胞用胰酶消化，按500 个/孔浓度转接于12 孔板中，各组均设3 个重复。每隔2 d 换液，培养1 周后，PBS 清洗2 次后晾干，多聚甲醛固定15 min 后清洗晾干，结晶紫染色15 min 后清洗、拍照并计数。

2.5 周期实验 将BBD 干预后细胞消化，轻柔吹打细胞，使细胞成单个悬浮状态而不成团。细胞离心去上清，PBS 清洗2 次后以预冷的70%乙醇溶液重悬细胞，4 ℃固定过夜。再以PBS 清洗2 次后，RNase Staining Solution 染色30 min 后流式细胞仪上机检测。

2.6 Q-PCR 法 将BBD 干预后细胞以Trizol 法提取总RNA，逆转录合成cDNA，八联管中制备Q-PCR反应体系，CFX touch 检测CT 值，并采用2-ΔΔCt法计算其表达水平的变化倍数。

2.7 Western Blot 法 收集细胞，加入适量RIPA裂解液提取总蛋白，蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度，计算上样量。蛋白在100 ℃的金属浴中变性10 min，经SDS-PAGE 电泳、转膜、5%牛奶封闭1 h后一抗（4 ℃过夜）、二抗孵育、显影并进行灰度值分析。

2.8 统计学方法 采用SPSS 16.0 软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 4 组细胞形态及存活率比较 不同浓度BBD（0、0.5、1、2 mg/mL）干预HCT116 细胞24 h 后，显微下观察发现，细胞密度随着BBD 浓度的增加而逐渐下降。台盼蓝染色计数法结果显示，经BBD 干预后，细胞存活率显著下降（P＜0.01）。见图1。

图1 4 组细胞形态及存活率比较（×100）

3.2 4 组细胞活力比较 与0 mg/mL 组比较，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干预HCT116细胞24 h后，HCT116细胞的细胞活力显著下降（P＜0.01），见图2。

图2 4 组细胞活力比较

3.3 4组细胞集落形成情况比较 与0 mg/mL 组比较，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干预后的HCT116 细胞集落形成数量显著减少（P＜0.05），以2 mg/mL 的BBD对集落形成数量的抑制作用最强（P＜0.01），见图3。

3.4 4 组细胞周期情况比较 与0 mg/mL 组比较，BBD（0.5、1、2 mg/mL）干预HCT116 细胞24 h 后，HCT116 细胞G0/G1 期比例显著增加（P＜0.05），1 mg/mL 组周期抑制作用增强（P＜0.01），S 期比例显著下降（P＜0.05），见图4，表明BBD 阻遏细胞周期于G0/G1 期。

3.5 4 组细胞CDK4 和Cyclin D1 基因水平比较 与0 mg/mL 组比较，2 mg/mL 组CDK4、Cyclin D1 的基因水平明显被抑制（P＜0.05，P＜0.01），见图5，提示高浓度的BBD 显著抑制CDK4 及Cyclin D1 的转录表达水平。

3.6 4 组细胞CDK4 和Cyclin D1 蛋白表达比较 与0 mg/mL 组比较，2 mg/mL 组CDK4、Cyclin D1 的蛋白相对表达量明显下降（P＜0.05，P＜0.01），见图6，提示高浓度的BBD 显著抑制CDK4 及Cyclin D1 的蛋白表达。

图3 4 组细胞集落形成情况比较

图4 BBD 对结肠癌细胞周期分布的影响

图5 4 组细胞CDK4 和Cyclin D1 基因水平比较

4 讨 论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，常用治疗手段为手术切除病理部位并辅以放疗、化疗，其临床表现多为腹部不适，出现腹部肿块，且伴随消瘦、无力等全身症状［8］。中医学认为结肠癌与“癌毒”入侵、“正气”衰弱密切相关，多数结肠癌患者伴随气滞、痰湿、血瘀、热毒［9］，而中药则可以通过直接提升“正气”来祛除病邪，或通过补脾、补肾、补益气血、清热解毒等方式间接抵抗毒邪侵袭，用于癌症治疗具有良好的增效减毒功能［10］。BBD 主药麝香、三七、牛黄均具有一定的抗肿瘤作用［11-13］，诸药合用具有显著的活血止痛、清热解毒的功效，具有抗炎、抗肿瘤的作用，在临床上常用于免疫性疾病、血液病、中医湿热毒瘀证等方面的治疗［4］。前期研究发现BBD 能通过调控细胞周期抑制肿瘤细胞生长［14］，提示BBD 可能通过阻碍细胞周期进程来抑制结肠癌细胞生长。

细胞周期调控细胞生长的全过程，其正常运行是保证细胞正常生长繁殖的必要条件。若其调控机制紊乱，细胞异常增殖，最终会导致肿瘤的发生。本研究采用流式细胞技术检测BBD 对结肠癌细胞周期的影响，结果发现BBD 能阻滞结肠癌细胞于G0/G1 阶段，提示其能通过抑制细胞周期来抑制结肠癌细胞的过度增殖。

图6 4 组细胞CDK4 和Cyclin D1 蛋白表达比较

在细胞周期进程中，细胞周期蛋白（Cyclin）常与细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）结合成复合物，从而调控细胞周期。CDK4 是CDK 家族的一员，已被确认是一种与良恶性肿瘤疾病相关的癌基因，在多种肿瘤细胞中异常表达，能为早期诊断肿瘤提供可能［15］。Cyclin 家族中Cyclin D 与肿瘤的发生、发展关系最为紧密，Cyclin D1 在其中具有重要的地位，其表达下调可缩短G1 期，阻碍细胞生长进程，相反其高表达具有推进癌细胞进展的作用［16］。Cyclin D1在细胞G1 阶段的早期表达增强，它能与CDK4 结合，并通过Cyclin/CDK4 途径跨越G1 调节点，是G1至S 期的主要调节因子［17］。在细胞周期中，G1/S期为细胞内外信号在细胞核中聚集的关键调节点，具有调控细胞增殖的作用，故其调控机制紊乱可诱发癌症［18］。据报道，CDK4 和Cyclin D1 的过表达是结肠癌的特征之一［18］，本研究结果显示，BBD 抑制Cyclin D1 和CDK4 的基因水平和蛋白表达，阻遏细胞于GO/G1 期，提示了BBD 可能通过调控Cyclin D1/CDK4 抑制结肠癌细胞生长。