溃疡性结肠炎患者血清Rac1、ACE2水平与肠道功能损害的相关性

王杨，田玉伟

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性复发性结肠疾病，其特征是对肠道菌群的先天性和适应性免疫反应失调，导致肠道炎症过程的持续存在，主要涉及直肠、结肠黏膜和黏膜下层等部位，以腹泻、脓血便、腹痛为主要临床表现，目前认为其机制与肠道屏障功能、遗传环境及肠道感染等相关[1-3]。研究发现Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)是Rho GTP酶家族的Rac亚家族中的一员，具有多种生物学功能，如可调控细胞增殖与凋亡、吞噬作用、细胞迁移、侵袭与转移、血管生成等，是一种关键信号传感器，已被证明可控制细胞炎症反应[4-5]。血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2) 主要在肺和肠的上皮细胞中表达，肠道可能是病毒袭击的潜在靶器官[6]。ACE2不仅参与水盐代谢以及血压调节，在炎症反应中也发挥关键作用，如申正杰等[7]研究发现腹泻猪中ACE2水平显著下调，导致炎性发展，进而导致死亡。肠道屏障功能可以防止毒素、细菌等有害物质穿过肠黏膜侵入人体内其他器官、组织，而炎症级联反应可能通过各种机制导致肠道屏障破坏，进而导致疾病的加重[8]。但ACE2与Rac1水平对肠道屏障功能的研究较少，因此本研究对UC患者血清中ACE2与Rac1水平进行检测，分析其与肠道屏障功能的关系，现将相关结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年3月至2022年3月驻马店中心医院就诊的UC患者60例，其中男28例，女32例，年龄18～68岁，平均年龄(45.22±4.52)岁，记为病例组。根据Mayo评分标准进行分组，0分：排便无出血现象且次数正常；1分：排便次数增加1～2次且不到一半时间内出现便中混血，内镜检测轻度病变；2分：排便次数增加3～4次，大多数大便中带血，内镜检测中度病变；3分：排便次数增加5次及以上，一直存在出血，内镜检测重度病变。60例UC患者中Mayo评分≤2分为缓解期组、＞2分为活动期组，其中活动期组UC患者36例，男15例，女21例，年龄20～68岁，平均年龄(44.88±5.02)岁；缓解期组UC患者24例，男13例，女11例，年龄18～66岁，平均年龄(45.74±3.76)岁；选取同期健康体检者40例，男19例，女21例，年龄21～66岁，平均年龄(44.28±4.27)岁，记为对照组。对比病例组、对照组在年龄、性别等方面差异无统计学意义，具有可比性(P＞0.05)。本研究患者均签署知情同意书，并经驻马店中心医院医院伦理委员会审核通过(批号：202020012)。

1.2 选取标准 UC患者诊断标准：符合《中国炎症性肠病组织病理诊断共识意见》[9]中诊断标准；相关量表评估资料、就诊资料等临床资料保存完整。排除标准：哺乳期、妊娠期女性；患有其他疾病如免疫性疾病、心肺疾病、感染性疾病、肝肾疾病、精神疾病、肿瘤疾病、血液性疾病患者；合并肠梗阻、穿孔等结肠扩张；无法配合完成本研究者如认知功能障碍等。

1.3 主要试剂与仪器 美国罗氏公司提供荧光定量PCR 仪；北京索莱宝科技有限公司提供RT-PCR试剂盒；上海生工生物工程股份有限公司提供ACE2 ELISA试剂盒；Bio-Rad公司提供酶标仪(MODEL550型)；长沙英泰仪器有限公司提供TD5A自动离心机。

1.4 研究方法

1.4.1 样本采集 60例UC患者及40例健康体检者分别于清晨抽取空腹静脉血9 mL，3 000 r/min离心10 min，将分离得到的血清置入-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 ELISA法检测血清ACE2水平 收集1.4.1中血清样本，严格按照ACE2 ELISA试剂盒操作步骤严格进行检测血清中ACE2水平。

1.4.3 肠道功能指标检测 收集1.4.1中血清样本，送至驻马店中心医院检验科检测肠道屏障指标(血清二胺氧化酶、细菌内毒素、D-乳酸)。

1.4.4 qRT-PCR检测血清中Rac1 mRNA表达水平

收集1.4.1中血清样本，采用Ficoll密度梯度分离法分离血清中单核细胞，加入TRIzol试剂充分吹打混匀使其裂解，制备细胞悬液进行提取RNA，具体操作：加入氯仿溶液，室温静置片刻后进行离心，3 500 r/min离心15 min，将上层水相转移至离心管中，之后加入异丙醇溶液，按照上述操作再次离心，离心后弃上清，管底沉淀即为RNA。加10 μL的RNase free H2O，充分溶解RNA，将RNA在PCR仪中，于85 ℃下5 s，37 ℃下15 min逆转录合成cDNA。配制定量20 μL PCR体系，于荧光定量PCR仪上进行扩增反应，设置条件：95 ℃下预变性5 min，95 ℃下变性10 s，退火30 s，72 ℃下延伸1 min。采用2-△△Ct法计算Rac1 mRNA表达量。其中Rac1引物序列及相应内参GAPDH引物序列，见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 统计学方法 数据均采用SPSS 23.0处理，计量资料如血清中Rac1、ACE2水平以及肠道屏障指标(血清二胺氧化酶、细菌内毒素、D-乳酸)等以均数±标准差(±s)表示，行t检验；Pearson法分析UC患者血清中Rac1、ACE2水平与肠道功能损害的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比较 与对照组相比，病例组患者血清中ACE2、Rac1 mRNA水平显著下降(P＜0.05)，见表2。

表2 两组血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比较(±s)

表2 两组血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比较(±s)

注：ACE2＝血管紧张素转化酶2，Rac1＝Ras相关的C3肉毒素底物1；下同。

组别 例数 ACE2/(pg·mL-1) Rac1 mRNA对照组 40 322.24±32.23 1.02±0.11病例组 60 267.96±26.80 0.81±0.08 t值 9.143 11.050 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 病例组中缓解期组和活动期组血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比较 与缓解期组相比，活动期组患者血清中ACE2、Rac1 mRNA水平显著下降(P＜0.05)，见表3。

表3 病例组中缓解期组和活动期组血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比较(±s)

表3 病例组中缓解期组和活动期组血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比较(±s)

组别 例数 ACE2/(pg·mL-1) Rac1 mRNA缓解期组 24 291.18±29.12 0.89±0.09活动期组 36 252.48±25.25 0.75±0.08 t值 5.469 6.316 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 两组血清中肠道屏障指标水平比较 与对照组相比，病例组患者血清中二胺氧化酶、细菌内毒素、D-乳酸水平显著增加(P＜0.05)，见表4。

表4 两组血清中肠道屏障指标水平比较(±s)

表4 两组血清中肠道屏障指标水平比较(±s)

?组别 例数 二胺氧化酶/(U·mL-1) 细菌内毒素/(EU·mL-1) D- 乳酸/(μg·mL-1)对照组 40 2.48±0.25 0.45±0.05 7.24±0.73病例组 60 3.15±0.32 0.58±0.06 8.78±0.88 t值 11.159 11.325 9.160 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 UC患者血清中ACE2、Rac1 水平的相关性

Pearson法结果显示，UC患者血清中Rac1 mRNA与ACE2呈正相关(r＝0.390，P＜0.05)，见图1。

图1 UC患者血清中ACE2、Rac1水平的相关性

2.5 UC患者血清中ACE2、Rac1mRNA与肠道屏障指标水平的相关性 UC患者血清中Rac1 mRNA、ACE2分别与二胺氧化酶、细菌内毒素、D-乳酸水平呈负相关(P＜0.05)，见表5。

表5 UC患者血清中ACE2、Rac1 mRNA与肠道屏障指标水平的相关性

3 讨论

UC是一种复发和缓解的炎症性肠病，其特征是黏膜炎症，从远端开始，可向近端延伸，累及整个结肠，其发病率和患病率均在增加[10]。虽然皮质类固醇、益生菌、5-氨基水杨酸、免疫抑制剂和生物制剂已成功缓解症状，但依然存在高复发率以及不可避免的副作用如恶心、呕吐、骨髓抑制、感染概率和致癌风险等，因此需要进一步关注UC进展中的指标变化，对于其临床治疗意义重大[11]。

肠道是全身性菌血症和毒血症的发源地，也是多器官功能障碍综合征的枢纽器官，是炎症介质的扩增器，而许多重症患者的预后往往与肠道屏障功能密切相关[12]。如周文浩等[13]研究发现乙型肝炎肝硬化患者存在肠道屏障功能被破坏，关注患者血清中胰岛素样生长因子Ⅰ水平变化，有助于判断肠道屏障功能损伤。二胺氧化酶、细菌内毒素、D-乳酸是目前临床上多采用间接反映胃肠黏膜细胞功能的方法[14]。二胺氧化酶主要存在小肠黏膜上层绒毛中，当肠道屏障功能被破坏时，在外周血中的二胺氧化酶的含量便会由稳定状态急剧增加，进入血液中循环。D-乳酸是细菌代谢产物，当肠黏膜受损时，便会引发细菌大量滋生，致使D-乳酸在肠道内积累。而内毒素在机体正常情况下仅仅存在于肠道内，肠道屏障功能一旦被破坏，便会穿过肠黏膜进入血液循环，导致内毒血症发生。因此本实验对UC患者血清中二胺氧化酶、细菌内毒素、D-乳酸含量进行了检测，结果显示UC患者血清中二胺氧化酶、细菌内毒素、D-乳酸含量较健康体检者显著增加，表明UC患者均存在肠道屏障功能破损。

ACE2主要分布在肾脏、心脏等主要器官，是一种金属蛋白酶，具有缓解炎症、舒张血管的作用[15]。ACE2受体也在肾脏和胃肠道中表达，研究发现冠状病毒患者出现腹泻，且在呼吸道分泌物和粪便中检测到病毒存在，提示肠- 肺轴很可能受损[16]。杨旭辉等[17]研究发现在急性胰腺炎患者血清中ACE2水平显著降低，随着患者病情加重，ACE2水平也会持续降低，可作为预测该疾病的标志物。杨舒钧等[18]研究也证明了重症急性胰腺炎患者血清中ACE2水平较轻症患者下降。本研究发现UC患者血清中ACE2水平较健康者下降，且活动期患者ACE2水平较缓解期患者水平降低，提示ACE2水平与UC发展有关。Pearson法分析显示UC患者血清中ACE2水平与二胺氧化酶、细菌内毒素、D-乳酸呈负相关，表明UC患者血清中ACE2水平对评估肠道功能损害具有一定的临床价值。

Rac1基因作为一种转录因子，具有GTPase酶活性，可发挥参与肿瘤发病、调节免疫细胞等生物学功能[19]。研究发现在哮喘患者血清中，Rac1水平显著下降，水平越低，气道炎症越严重[20]。本研究发现UC患者血清中Rac1表达水平显著下降，随着病情的加重，其表达水平越降低，表明UC患者可能通过Rac1表达调节炎症反应。经Pearson法分析发现UC患者血清中Rac1表达与ACE2水平呈现正相关，共同参与UC发展。除此之外，UC患者血清中Rac1 表达还与二胺氧化酶、细菌内毒素、D- 乳酸呈负相关，提示评估UC患者血清Rac1、ACE2水平，可反映患者肠道功能损害，为更进一步治疗提供参考。

综上所述，UC患者血清中ACE2与Rac1水平显著下降，两者呈正相关，且均与肠道屏障指标呈负相关，表明检测两者水平可大致反映肠道功能损害状况，具有一定的临床价值。但本研究仅局限本医院调查，且样本数据偏少可能对结果造成偏倚，还需在后期研究中继续扩大样本、多中心进行分析。