表面增强拉曼光谱在食品安全检测中的应用研究

◎ 黄雅轩，蔡依含，何婉霞，张莉滟，赵 越

（1.南方医科大学附属广东省人民医院/广东省医学科学院检验科，广东 广州 510080；2.南方医科大学 检验与生物技术学院，广东 广州 510515；3.广州南方学院 云康医学与健康学院，广东 广州 510970）

食品是人们赖以生存的基本条件，食品安全直接关系到人们的生命健康，也是国家经济平稳发展的重要基石。全球每年约2 000 万人因食源性感染死亡，食品安全问题现已成为世界性的公共卫生问题[1]。世界卫生组织曾指出，食品安全是指食品在按照预期用途进行制备和（或）食用时，不会对消费者造成伤害。食品添加剂、动植物天然毒素、食源性感染如病毒等均可引发食品安全问题[2]。3 类污染物包括微生物（如细菌、真菌和病毒）、化学物质（如毒素、过敏原和农药）与物理污染物（如塑料、玻璃、金属和岩石），可在食品供应链中污染食品。

目前电化学生物传感器、病原学培养等方法仍是用于筛选和检测食源性致病菌的主要方法，但在实际检测过程中，由于信号干扰、灵敏度不足等因素，限制了对食源性病原体的有效检出[3]。而现实中检测部门应准确及时地检测出食品是否变质及所含有的有害病原体，因此急需探索新的检测方法，快速检出其中的污染物。

拉曼光谱（Raman Spectroscopy）作为现代物质分子结构研究的重要方法，被广泛应用于物质微结构研究。其主要通过拉曼位移确定物质结构，揭示分子生物特征[4]。拉曼位移即分子振动或转动频率，每种物质有其特征拉曼光谱。根据光谱中的拉曼峰创建独特的振动指纹，可从分子水平上鉴别物质[5-7]。表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）由于局部等离子体共振，显著提高了拉曼光谱强度，现已广泛用于食品安全检测。本文就SERS 技术与其在食品安全检测中对食源性病原体、化学及物理污染物鉴别的应用新进展、局限性和战略前景等方面作一综述。

1 食品中的污染物

1.1 食源性病原体

食源性病原体包括细菌、真菌和病毒，对全球食品安全行业造成了极大的影响[2]。其中最常见的食源性病原体是沙门氏菌，约有2 463 个血清型，以肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌检出最多[8]。沙门氏菌感染会引发呕吐、肠胃炎、腹泻和高热等。大肠埃希菌O157:H7 也会对人体造成极大危害，10%感染者会合并溶血尿毒症综合征（Hemolytic Uremic Syndrome，HUS），且致死率达3%～5%[9]。此外，铜绿假单胞菌同样可引起食源性疾病，每年造成美国各州约400 人死亡。其常对抗菌药物表现出高耐药性，在美国引起的51 000 例感染中，有6 000 例感染菌株为多重耐药菌[10]。李斯特菌亦能通过食品感染人体，且在过去数十年里，食品行业中出现了较多由李斯特菌引起的死亡案例。另外，人体摄入被耐甲氧西林金黄色葡萄球菌污染的食物后，1 ～6 h 内可出现严重的毒素反应，包括恶心呕吐、腹部不适等[11]。

病毒对食品安全同样构成重大威胁，与食源性疾病密切相关。因病毒在食物中无法复制，其通过食物传播的可能性取决于病毒的活力与其对宿主细胞的敏感性。甲型肝炎病毒和诺如病毒常导致食源性疾病，而戊型肝炎病毒、轮状病毒、星状病毒等与食源性肠胃炎相关性较低[12]。

1.2 食品中的有害化学物质

农药和毒物是引起食源性疾病暴发最常见的化学物质。在食品生产过程中，有害的化学物质可能会人为或意外进入食品供应链。为了达到改善食品外观、颜色、延长保质期等目的，某些物质会被有意添加到食品中。其他有害化学物质则可能是在制备、加工和储存过程中被无意加入。若食品中某些化学物质含量超标，将对人体造成损害。对因其自身性质即可影响健康的化学物质，则应被禁止使用[13]。广州食品药品监督管理局于2013 年第一季度对市内餐馆进行抽查，发现大米及米制品的镉含量高于建议水平44.4%，引发全社会的广泛关注。镉不是人体必需元素，而是一种环境污染物，过量摄入将导致镉中毒，现已被WHO 列为重点研究的食品污染物[14]。除镉以外，其他有害化学物质对人体造成的损害同样严重，务必要引起高度重视。

1.3 食品中的有害物理物质

有害的物理物质包括木头、石头、金属、塑料、玻璃和昆虫等，均不应在食品中出现。上述物质可因其自身特点，如大小、形状、硬度或锋利度等导致窒息、割伤或消化道刺穿，在我国这类有害物理物质已引发了重大食品安全事件[15]。在2014 2015 年，我国大陆地区共发生了360 起食品异物事件。其中生物类异物（昆虫等）最为多见，约占43.0%。此外，材料类异物（包括金属、玻璃、塑料等）、毛发类异物也较为常见，共占28.5%。在各类形状大小的异物中，一般以0.5 ～3.0 cm 的尺寸最为多见[16]。

2 表面增强拉曼光谱

每108个光子中仅有一个光子会自发产生拉曼散射，因而拉曼散射相对较难被识别，极大限制了可获得的拉曼信号强度[17]。一般可通过提高入射激光功率、使用显微镜把激光束集中于特定的微小区域来提高拉曼激光获取效率，但这可能会产生样品光漂白等干扰效果[18]。

印度物理学家拉曼最初发现，光在介质中传播时，散射光波长与入射光不同。拉曼散射是对改变频率光子的研究，可用于确定分子能量。然而，拉曼光谱的实际应用有限，拉曼信号在正常情况下强度较低，而过低的拉曼信号难以被传感器识别。FLEISCHMAN等[19]于1974 年发现吡啶分子吸附在粗糙银电极表面可增强拉曼散射信号。另外，分子吸附于活性载体表面可减少荧光产生，优化拉曼信号强度和质量，并增强其稳定性。

SERS 是一种超灵敏和高选择性的分析技术，金属NPs 或纳米结构金属被大量使用以增强固有微弱拉曼信号[20-21]。有两种不同的方法可增强SERS 中的拉曼信号，一是电磁增强，即在“热点”中靠近金属表面的原生电场被局部表面等离子体激元聚焦；二是将拉曼散射提高到102倍左右，并通过金属表面和样品之间的静电相互作用进行化学放大[22]。根据不同的SERS 底物，可分成两组介质，即吸附于固体基质上的金属纳米颗粒与胶体等离子体共振溶液。上述发展是电磁增强技术广泛应用的结果。金和银具有强烈的等离子体反应，常用作SERS 基底。由于金的化学稳定性极高，其最适合作为SERS 基底。此外，相关人员还针对其他金属进行研究，如用于紫外拉曼光谱的铝[23]。

有标记和无标记的SERS 技术是可用于细菌检测的两种方法。拉曼光谱可作为无标记的检测方法提供由分子振动光谱组成的“分子指纹”[24]。无标记SERS，即直接将细菌及其代谢物黏附于纳米结构物质表面。为识别待测物，可直接检测纳米区域内生物分子的特征拉曼光谱。而在有标记的检测中，需引入拉曼报告分子以产生SERS 信号。为捕获目标并实现特异性检测，配体（如抗体、适体或相关分子）常被固定在纳米结构物质表面，通过捕获前后拉曼光谱的变化可用来识别目标[25]。

3 SERS 在食品安全检测中的应用

3.1 检测食品中的病原菌

一些研究已通过拉曼光谱技术对食源性病原体在物种层面上进行分类，标记与无标记SERS 技术已用于细菌和病毒的识别。常用3 种不同的无标记SERS方法检测细菌，即细菌菌体鉴定、代谢产物鉴定和DNA 鉴定。而食源性疾病的诊断常涉及细菌检测，检测方法主要包括将细菌与胶体纳米颗粒充分混合，将细菌菌体直接放置在固体SERS 底物上，以及将胶体纳米颗粒直接组装到细菌表面。

通过结合SERS 技术、SIMCA 软件和银纳米颗粒，FAN 等[26]设计了一种通过磷酸盐缓冲液（PBS）检测7 种食源性病毒的技术。SUN 等[27]于2017 年创建了SERS 间接法来识别禽流感病毒（AIV），但在所有禽流感病毒株中，该法仅适用于H3N2型病毒。该方法需形成包括流感免疫球蛋白G（AIgG）、具有高SERS 活性Fe3O4/AuNPs 的类三明治结构，其中通过把AuNPs 与底物结合使其便于识别。该化合物由Fe3O4/AuNPs 与AuNPs 复合物、H3N2流感病毒亚型A与AuNPs 结合而成。通过产生磁场并在将化合物放在铝箔上之前添加Fe3O4/AuNPs，从而将病毒从化合物中分离出来。

WEI 等[4]通过SERS 成功识别出3 种食源性病原体，包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌O157:H7。该实验通过10 mL 银胶体纳米颗粒重悬细菌，使其浓度为107CFU·mL-1，并置于785 nm 激光下检测。基于光谱数据，研究者发现银胶体纳米颗粒可作为具有高灵敏度的SERS 活性底物。基于银颗粒圆柱纳米槽网络（Cylindrical Nanotrough Networks，CNNs）技术，ZHANG 等[28]通过对所测得SERS 光谱的主成分分析（PCA），成功实现了对两种大肠埃希菌的鉴别。LIAO 等[29]基于硅纳米线阵列（SiNWs）研发了一种用于捕获和区分细菌的新型生物介质。SiNWs-Au@Ag 底物对饮用水中的细菌表现出极强的捕获能力，即在40 min 内分别捕获8.6 106cells/cm2的大肠埃希菌和5.5 106cells/cm2的金黄色葡萄球菌。结合激光诱导击穿光谱（LIBS）和有标记SERS技术，可对饮用水中的细菌进行有效检测。为了能够特异且快速地在60 min 内检测牛奶中的大肠埃希菌，ILHAN 等[30]将SERS 技术与免疫分析相结合，检出率可达90%，且通过该法获得的结果与传统培养法相一致。

3.2 检测食品中的有害化学物质

传统的光谱检测技术包括冷原子吸收光谱、原子荧光光谱和荧光分光光度法，上述方法均会涉及昂贵的仪器，且需要制备高精度的样品以及较长的检测时间。而SERS 作为一种新型快速检测技术，能提供较多关于化学物质的光谱信息，且具有灵敏度高、无水干扰等特点，便于常规应用。

采用拉曼光谱技术可检测有害的食品添加剂，SUN 等[31]通过低成本的三聚氰胺泡沫材料（MF）作为SERS 底物，发现该底物对食物中的罗丹明B 和碱橙II 具有极高的灵敏度。其中罗丹明B 和碱性橙II 具有潜在致癌性、致突变性和心脏毒性，过量摄入会导致急性或慢性中毒。另一项研究使用具有扫描高光谱能力的拉曼成像设备，通过结合光谱线性相关的混合分析技术，在小麦粉存在其他未知污染物（如l-抗坏血酸、过氧化苯甲酰和偶氮二甲酰胺）的情况下检测出在多数国家被禁用的面粉改良剂溴酸钾[32]。

控制虫害数量和促进植物生长是农业中使用杀虫剂的两个目标。农药滥用导致药物遗留可能会对人体健康产生不同程度的影响。福美双作为一种杀虫剂，常在农业生产中被广泛使用。XIONG 等[33]利用纤维素纳米纤维（CNF）作为底物，制备了CNF/AuNP 纳米复合材料，用于快速、准确鉴定苹果汁中的福美双。该研究采用铵离子对CNF 进行阳离子化处理，并通过静电作用使其与柠檬酸盐稳定金纳米颗粒（AuNPs）结合形成均匀的纳米复合材料。

为治疗各种感染性疾病，抗菌药物被广泛应用于水产养殖和畜牧业。DHAKAL 等[34]于2018 年建立了一种直接有效的基于银胶体纳米颗粒的SERS 方法，用于检测流食中四环素（TC）的残留。该研究通过SERS 技术对不同浓度的水TC 溶液和牛奶TC 溶液进行分析，发现两种溶液的TC 残留量均为0.01 ppm。

3.3 检测食品中的有害物理物质

微塑料存在于环境中，当其出现在食品和饮料中会对人体健康造成一定影响。SERS 与网格石基质结合可用于识别小于360 nm 的聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯微塑料。强烈的热点由格子石基质产生，而格子石基质则是由金制成的复杂的反金字塔状腔室网格，SERS 还可用于对水中的微塑料碎片及一些杂质，包括荧光和微观颗粒进行鉴别[35-36]。LV 等[37]将SERS与银胶体基底结合使用，在纯水和海水中分别鉴定出了由聚丙烯、聚苯乙烯和聚乙烯构成的微塑料，大小从100 nm 到10 μm 不等。PRATA 等[38]采用微拉曼光谱技术对白葡萄酒中塑料颗粒进行检测，发现26 瓶中有24 瓶被检测到至少一种微塑料。

4 结语

拉曼光谱作为一种快速、无损、安全的分析技术，现已在食品安全、医疗保健等多领域中得到成功运用[39-40]。有研究表明，拉曼光谱在准确区分病原菌方面已优于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱[41]。其可对食品中的有害物质，包括病原体、环境污染物、塑料颗粒、农药、食品添加剂等，进行快速准确的鉴别，且样品前处理简便、重现性好。但将其广泛应用于食品行业，仍有较多问题尚待解决，如食物成分的复杂性，不同分子间的相互影响导致定量分析的精密度降低等。而为保证对特定分子检测结果的准确性，可采用的方法主要有增强底物特异性，使用合适的适体或抗体，通过静电相互作用增强带电化合物的吸附和识别能力等。

再者由于一些污染物可能渗入组织，将难以通过原位检测或表面采样进行完全提取和精确识别。为计算和确定目标分析物样品的实际浓度，可建立描述穿透速率和时间之间关系的模型。还可探讨将SERS 与激光诱导击穿光谱相结合，增强识别能力，实现对病原体的精确检测。此外，还需解决荧光对检测过程的影响，其可降低底物的敏感性，并可能导致原位检测出现偏差。目前石墨烯或氧化石墨烯对不同纳米粒子及分析物具有有效的亚纳米隔离层功能，可将信号波动维持在较低水平，减少荧光干扰，保证拉曼信号的准确度。

SERS技术在食品安全检测中的应用具有广阔前景，未来仍需加强对新技术的研发，以提升对食品污染物的检测能力，更好地保障人们的饮食安全和生命健康。