食品中克罗诺杆菌分子分型方法研究进展

◎ 周 钦，王宇轩，顾佳丰，余红民，姜 华，李远宏

（徐州医科大学，江苏 徐州 221004）

克罗诺杆菌（Cronobacterspp.，CR）是一种重要的食源性条件致病菌，可引起婴幼儿脑膜炎、菌血症、坏死性结肠炎等疾病，严重威胁食品安全和人类健康。现有研究表明，婴儿配方奶粉是导致CR 感染的重要渠道，但是该菌在谷类、肉类、果蔬类和香辛料等食品中也广泛存在。CR 包括7 个种和3 个亚种，属类不同分型的CR 在生存能力、毒力与耐药性等方面存在较大差异[1]。分子分型技术是一种在食源性疾病暴发和溯源调查中被广泛应用的技术，通过该技术可以在分子水平快速实现对致病菌的识别和鉴定，解析菌株的遗传演化规律与分子遗传特征，为预防和控制CR 引起的感染提供理论依据。基于此，本文对CR的分子分型方法进行简要综述。

1 多重PCR 法

多重PCR 法（Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR）是在同一反应体系下，同时加入两对或两对以上引物进行PCR 扩增，通过PCR 扩增获得大小不等的DNA 片段，可以实现对多种病原菌的同时检测与分析。CARTER 等[2]基于mPCR 技术建立了一种可同时区分6 种CR 的分子分型方法。该方法基于cgcA基因设计特异性引物进行mPCR 扩增，获得不同大小的DNA 片段，并通过凝胶电泳将各扩增产物分离，以实现对不同种CR 的鉴别。mPCR 分型是一种较早开发的用于CR 种间区分的分子分型方法，这种技术具有准确度高、操作简单快捷、费用较低等多种优点。该方法能在种水平实现对CR 的鉴定，但是其分辨率较低，无法在基因水平检测到不同菌株的变异情况，因此限制了其在诊断、鉴别、溯源和监测等方面的广泛应用。

2 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是20 世纪80 年代中期发展起来的一种通过电泳分离大分子DNA 的技术，其基本原理是利用稀有位点的限制性内切酶（如XbaI、SpeI）切割细菌基因组DNA，得到的大片段DNA 在脉冲电场作用下进行分离，然后再依据DNA 片段的大小、数量及相对位置关系将不同菌株划分为不同的基因型。PFGE 是被广泛认可的用于细菌分子分型的“黄金标准”方法，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌、致病性大肠杆菌O157、副溶血弧菌和CR 等食源性致病菌具有很强的鉴定能力。MULLANE 等[3]对30 株CR 分离株进行PFGE 分析，通过XbaI 酶切后，利用随机引物扩增出3 ～7 条长度为400 ～3 500 bp的DNA 片段，聚类分析后16 株分离株鉴定为丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus），14 株分离株鉴定为阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）。LI 等[4]利用PFGE 方法对2008 2018 年温州市食品和粪便样本中分离的CR 进行分型，将90 株CR 划分为75 个克隆群，其中86 株鉴定为C. sakazakii，4 株鉴定为C.malonaticus。PFGE 分型技术具有重复性好、分辨率高以及易于标准化等诸多优点，而且结果稳定可靠，不受表型性状干扰。但是，该方法也存在一些缺陷，如仪器试剂昂贵、过程烦琐、耗时长、对操作人员的素质要求高等，从而限制了该技术的推广普及。

3 随机多态性扩增DNA

随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）分型技术采用随机引物对基因组DNA 进行PCR 扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR 扩增产物，进而分析片段多态性。DRUDY 等[5]分析51 株CR 分离株和6 株CR 标准菌株的RAPD图谱，发现这些菌株产生了3 ～11 个大小为350 ～2 600 bp 的扩增产物，聚类分析发现大部分菌株被划至3 个簇群。杨海荣等[6]利用RAPD 技术对38 株CR进行了分子分型分析，利用随机引物扩增出3 ～7 条长度为400 ～3 500 bp 的DNA 片段，并将这些菌株划分为8 个基因型，证实了RAPD 技术可用于CR 种间鉴别和分子溯源分析。RAPD 分型方法工作原理简单、成本低、耗时短、易于操作，且不需要全基因组序列信息来确定特定的靶标，但是不足之处在于可重复性差，技术路线尚未实现标准化，无法区分等位基因，可能会出现假阳性或假阴性结果，因此对实验结果的解释具有较大的主观性。

4 扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是一种用于DNA 多态性的检测方法，由荷兰科学家Zabean 和Vos 于1992 年首次提出。该方法首先利用限制性内切酶切割基因组DNA，得到带有不同酶切末端的限制性酶切片段，然后在酶切片段上加上双链接头，作为PCR 扩增时引物的结合区，再通过选择性引物进行PCR 扩增，最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增片段的多态性。IVERSEN 等[7]建立了一种可区分CR 的AFLP 方法，采用限制性内切酶EcoR I 和Taq I 对51 株CR 基因组DNA 进行了酶切，然后将酶切后的基因组DNA 与人工接头在T4 连接酶的作用下连接，以连接了接头的DNA 为模板进行PCR 扩增，扩增结束后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。AFLP 图谱分析结果显示，以相似度70%为基准，51 株CR 菌株被划分为4 个生物群。另一项研究中，TURCOVSKY 等[8]利用AFLP 技术对98 株CR 进行了分析，以相似度70%为基准，可以将这些菌株划分为6 个生物群，而以相似度90%为基准，可以将这些菌株划分为46 个生物群。目前，CR的AFLP 分型技术尚未实现标准化，其具体的操作流程还有待于进一步规范。AFLP 在细菌分子分型中表现出较好的重复性，其分辨能力优于RAPD，但不及PFGE，并且只能检测到CR 种间基因组差异，对于CR 种内不同亚型的基因组差异则无法完全鉴定。

5 PCR-限制性片段长度多态性

PCR-限制性片段长度多态性（PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）是一种将PCR技术、RFLP 与凝胶电泳技术联用的基因多态性分析技术，其原理是先将待测的靶DNA 片段进行PCR 扩增，然后通过限制性内切酶对PCR 产物进行酶切，获得不同长度的DNA 片段，经琼脂糖凝胶电泳分析靶DNA 片段的分子量大小而分型。STRYDOM 等[9]基于rpoB基因序列建立了一种可以区分5 种CR 的PCR-RFLP分子分型方法。首先，通过设计特异性引物进行PCR扩增，获得长度为660 bp 的rpoB基因片段，然后利用限制性内切酶Csp6I 和HinP1I 单独或联合消化PCR扩增产物，最后依据琼脂糖凝胶电泳图谱的差异将不同种CR 区分开来。VLACH 等[10]建立了一种新的PCR-RFLP 分型方法，该方法使用一对新设计的引物对rpoB基因序列（1 635 bp）进行PCR 扩增，再采用3 种限制性核酸内切酶（Csp6I、HinP1I、MboI）消化，可区分全部7 种CR。PCR-RFLP 分型方法操作简单、快速、可重复性好、不需要特殊设备，且区分力较高，但其缺点是实验结果往往因人而异，不便于在各实验室之间进行比较。

6 多位点序列分型

多位点序列分型（Multiple-Locus Sequence Typing，MLST）是一种基于核酸序列测定的细菌分子分型方法，它通过PCR 扩增多个管家基因（通常为7 个）的内部片段，然后测定这些片段的序列以分析不同菌株的变异程度，从而进行对不同菌株的分型。CR 的MLST 是基于7 个管家基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和pps）序列建立的，为CR 的分子流行病学研究提供了强大的解决方案。LI 等[4]利用MLST 对温州市食品（n=78）和临床（n=12）来源的CR 种群结构和耐药模式进行了分析，结果发现了43 种序列型（Sequence Type，ST） ，其中ST1、ST4、ST8、ST64、ST148 和ST201 最为常见。马炳存等[11]调查了即食食品中CR 的污染状况，并采用MLST 对分离得到的10 株CR 进行分子分型分析，结果将这些菌株分为4 个ST 型（ST21、ST73、ST60、ST7）。MLST具有分辨率高、重复性好、可标准化等优势，其数据结果易于通过网络实现信息共享，且便于不同实验室间对比分析，因此广泛应用于细菌分子分型和分子进化研究领域。

7 全基因组测序分型

全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）分型是通过高通量测序平台对致病微生物进行全基因组测序后，利用生物信息学方法得到全基因组序列，从基因水平解析不同菌株的分子遗传特征而进行的分子分型，从而快速准确地解析不同菌株之间的分子进化关系和遗传特征。PARRA-FLORES等[12]利用高通量测序技术对CR 进行了核心基因组多位点序列分型（Coregenome Multilocus Sequence Typing，cgMLST），将7 株从奶粉中分离出的CR 划分为2 种ST 型（ST1 和ST83），并基于全基因组序列揭示了分离株的多种抗生素耐药基因和毒力基因。HOLÝ 等[13]利用高通量测序技术对从食品和奶粉生产环境中分离的CR 进行了全基因组测序，利用抗生素耐药数据库（CARD）、ResFinder 和PlasmidFinder 解析了菌株携带的耐药基因和毒力基因，利用系统进化树揭示了不同菌株之间的系统发育关系，并基于全基因组信息分析了与环境适应相关的功能基因。相对于其他分子分型技术，WGS 可以更全面、准确地描述不同来源分离株的遗传特征，为精准解析致病菌的耐药性、毒力以及致病性提供了帮助，为揭示流行相关菌株的传染源、传播途径和流行规律提供了参考，现已成为分子流行病学研究领域的一个重要的技术手段。

8 结语

CR 是一种新兴的食源性条件致病菌，与导致婴幼儿脑膜炎、菌血症、坏死性结肠炎等威胁生命的感染有关。分子分型方法对于CR 的流行病学研究有着至关重要的作用，而基于表型差异建立的传统分型方法如生化分型、血清分型等，已不能满足当前分子流行病学研究的需要。基于DNA 的分子分型技术，尤其是WGS，由于其具有的准确、快速、高分辨率等特性，必将成为CR 分子流行病学领域中的重要研究工具，在病原菌的快速分型鉴定、分子进化、追踪污染源等方面发挥重要作用，从而为食品安全提供有力保障。