功能性食品中氨基酸检测方法研究进展

◎ 陈 晨，陈 妍，陈 婷，倪炜华，王丽丽，施文婷

（嘉兴市食品药品与产品质量检验检测院，浙江 嘉兴 314001）

随着现代食品工业的快速发展，人们的收入水平不断提高，对食品的认知也得到了提升，现代人们更注重食品的营养价值，更强调科学的饮食结构，具有特殊营养价值和保健功能的食品逐渐成为食品消费的主流。功能性食品作为集营养、保健、增强体质、改善机体功能于一身的新型食品[1-2]，比起普通食品，能够实现功能化、精准化的营养补充。人们可结合自身实际，通过合理饮食和科学补充营养，实现维持机体健康、有效预防和控制疾病发生的目的[3-4]。因此，功能性食品在当前有着非常广泛的市场和群体受用基础。

功能性食品根据不同特定人群的需要而添加相应的功能性因子，如功能性糖类[5]、维生素[6]、皂苷[7]、氨基酸[8]等，因其功效丰富，备受产品生产企业与消费者的青睐。目前功能性因子的种类呈现多元性，针对功能性食品中功能性因子的检测方法逐渐增多，建立快速有效的检测方法，构建功能性食品中通用的品质评价准则和规范，对促进功能性食品的发展及“健康中国”国家战略的实施具有极其重要的意义。其中，氨基酸是构成人体营养所需蛋白质的基本物质，而蛋白质又是人体的生命基础[9]。作为功能性食品中常用的功能性因子，以其为主要功能性成分的功能性食品种类繁多，然而各类产品的品质参差不齐，因此对氨基酸类功能性食品进行检测显得尤为必要。

1 氨基酸检测技术

1.1 氨基酸分析仪法

氨基酸分析仪先将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，然后再进行氨基酸分析，是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱仪。氨基酸分析仪是进行氨基酸分离、衍生和检测的全自动化专用分析仪器，能够在普通实验室中配备，操作方便，分离度和重现性较好，且能够进行批量检验，但一般价格昂贵。

姜荷等[10]采用氨基酸分析仪，建立了同时测定功能性饮料中游离牛磺酸和赖氨酸的定量测定方法。牛磺酸和赖氨酸的最低检出限均为2 nmol·mL-1，线性范围均为6 ～100 nmol·mL-1，相关系数均大于0.999 7，RSD 均小于5%，回收率在98.7%～100.2%。此方法灵敏度高、操作简单、重复性好、切实可行。于方园等[11]采用氨基酸分析法对牛乳和大豆蛋白中的多种氨基酸进行分析检测，不同浓度梯度加标回收率均在94.2%～103.1%，RSD 在0.89%～3.31%。该方法利用氨基酸分析仪，通过模拟掺假实验对牛乳和大豆蛋白中的17 种氨基酸进行测定比较，发现牛乳中的大豆分离蛋白掺假量可通过天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸6 种特定氨基酸的总含量进行计算，方法简便，灵敏度高，为牛乳中大豆分离蛋白的掺假鉴别提供了一种新的检测方法。钟秋瓒[12]利用氨基酸分析仪测定乳饮料及乳制品中游离甘氨酸含量，研究了样品前处理方法和仪器色谱分离条件对乳饮料及乳制品中甘氨酸测定的影响。该方法具有较好的重现性，加标回收率为96.4%～100.6%，方法精密度为0.99%，标准曲线线性相关系数为0.999 9。冯志强等[13]用氨基酸分析仪测定含乳饮料中游离甘氨酸含量，研究了样品预处理方法和仪器色谱分离条件。测得含乳饮料中游离甘氨酸的含量，从而对含乳饮料中是否添加甘氨酸进行分析，此方法具有较好的重现性，添加标准的回收率为98.8%～101.7%，方法精密度为0.53%。SHIM 等[14]利用氨基酸分析仪同时测定婴幼儿配方奶粉中16 种氨基酸。氨基酸的回收率在87.18%～118.08%，LOD ＜0.059 mg/100 g，LOQ ＜0.198 mg/100 g。

1.2 分光光度法

分光光度法主要利用氨基酸与茚三酮产生蓝紫色化合物，测定在某一波长处最大吸收峰值的大小，从而得到氨基酸的含量。此方法检测成本低且操作方便，适用范围广泛，但只能测定一种或一类氨基酸的总含量，不能进行氨基酸的分离[15]。

周菊峰等[16]用差示分光光度法测定决明子中的8 种必需氨基酸，氨基酸与茚三酮生成蓝紫色化合物，在8 种必需氨基酸最大吸收波长处分别测定吸光度。该法简便、准确，结果可靠，适用于内含决明子的功能性食品中各类氨基酸的测定。杨葵华等[17]采用单因素试验对提取条件进行探究，氨基酸与茚三酮显色后，用分光光度法测定人参果中氨基酸含量。结果表明，氨基酸含量在2 ～12 mg·mL-1线性关系良好，平均回收率为99.5%，RSD 为2.9%。胡京枝等[18]对含乳饮料中游离氨基酸含量的试验条件进行了研究，建立了紫外分光光度法测定游离氨基酸含量的测定方法，该方法同样具有良好的回收率和重复性。

1.3 近红外光谱法

近红外光谱法主要利用有机化合物的含氢基团在特定波长范围内跃迁，产生光谱变化，结合统计方法间接实现氨基酸的定量检测，具有简单、快速、无损、环保无污染以及同时测定等优点。

陶琳丽等[19]研究了20 种氨基酸的分子结构与其近红外光谱的相关性，为在功能性食品中氨基酸的检测奠定了一定的理论基础。研究表明，20 种氨基酸在1 000 ～2 502 nm 区域主要存在4 个特征光谱区，有非常明显的近红外光谱吸收且差异显著。因此，可以利用此4 个近红外光谱特征区域对氨基酸进行定量和定性分析，提高氨基酸近红外光谱模型预测的准确性。赵琛等[20]提出了用近红外漫反射光谱技术快速检测发酵冬虫夏草[21]中氨基酸含量的新方法。在一定光谱区域范围内建立了近红外光谱数据与氨基酸、精氨酸和总氨酸含量间的定量关联模型，为以冬虫夏草加工成的功能性食品中氨基酸含量的测定提供一条新的途径。龚加顺等[22]以140 个茶饮料样品为试材，探讨了近红外线光谱技术（Near Infrared Spectrum Instrument，NIRS）快速测定共饮料品质相关成分的可行性。试验结果表明，所建立的品质成分近红外校正模型可应用于茶饮料的总氨基酸（Total Amino Acids，TAA）的快速检测分析，而无需任何化学药品。

1.4 电化学分析法

电化学分析法一般是采用不同种类的氨基酸选择性电极对其进行各种氨基酸的测定。因具有检测时间短、检测种类多、无放射无污染等优势，近年来得到了迅速发展[23]。

王力等[24]根据L-赖氨酸（L-lysine）具有增强三联吡啶钌[Ru(bpy)32+]电化学发光信号的特性，建立一种毛细管电泳-电化学发光分离检测L-赖氨酸的新方法。该方法已成功用于饮料中L-赖氨酸的检测，结果令人满意，对于部分功能性饮料同样适用。李笑笑[25]利用毛细管电泳与电化学联用体系检测含乳饮料中游离甘氨酸，以自制的石墨圆盘电极为工作电极，得到最低检测限（S/N=3）为7.9 10-7mol·L-1，乳饮料中游离甘氨酸的加标回收率为83%～109%，为检测功能性饮料中的氨基酸提供新的方法。

1.5 色谱法

色谱检测主要利用某一特定的色谱系统（薄层色谱、高效液相色谱或气相色谱等系统）进行混合物中各组分的分离分析，广泛用于分析多组分样品。色谱检测种类较多，按流动相分有液相色谱、气相色谱、超临界流体色谱等，按固定相分有填充柱色谱、毛细管柱色谱、微填充柱色谱等。色谱法具有分析速度快、分离效率高、选择性好等优点。

陈贯昊[26]建立了梯度淋洗-离子色谱-积分脉冲安培检测法同时测定运动饮料中20 种氨基酸和6 种糖的分析方法。通过对梯度淋洗条件、色谱柱温度、pH 值以及前处理条件等实验影响因素的考察，优化出适合同时检测26 种组分的分析方法。检出限为0.001 ～0.060 mg·L-1，加标回收率达到86.2%～105.0%（n=5），该方法高效、简便、灵敏、准确，可用于运动饮料中多种氨基酸和糖的同时测定分析。冯盛斌等[27]建立反相高效液相色谱法检测维生素功能饮料中L-赖氨酸的含量的分析方法。牛磺酸在线性范围内相关系数r＞0.999，回收率大于97.6。结果表明，该方法操作性强、灵敏度高，适用于维生素功能饮料中L-赖氨酸的检测。胡建鸿等[28]建立反相高效液相色谱法（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）同时测定氨基酸保健饮品中16 种氨基酸的分析方法。在各氨基酸的线性范围内，16 种氨基酸的线性相关系数r在0.999 6 ～0.999 9，平均回收率为96.0%～104.0%。结果表明，本方法专属性强，操作方便，灵敏度高，可用于氨基饮料中氨基酸的含量检测。贺习文等[29]建立了离子交换色谱-柱后衍生法测定绿茶饮料中39 种游离氨基酸的分析方法。经过磺酸型阳离子交换色谱柱分离，茚三酮柱后衍生，调节流动相比例和柱温，39 种游离氨基酸均得到了较好的分离。该方法前处理简单易操作、实用性强，适用于绿茶饮料中39 种游离氨基酸的检测。

1.6 质谱法

质谱作为高选择性和高灵敏度的检测工具，在氨基酸分析中发挥着重要作用。质谱技术检测氨基酸主要是根据其质荷比信号推导出分子质量来实现的，蛋白质经完全水解后产生单个的氨基酸残基，通过质谱分析可以获得其质荷比信息，通常结合需要结合色谱技术进行鉴定，如LC-MS 以及LC-MS/MS 等。

董亚蕾等[30]建立一种用于检测富硒食品中4 种硒代氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱法方法。结果口服液中，4 种硒代氨基酸的线性关系良好（r＞0.996），平均回收率为89.0%～104.5%，相对标准偏差均小于7%。该方法对简单基质的样品中硒代氨基酸的测定结果准确可靠，但基质效应较为明显。陶弥锋[31]建立了一种超高效液相色谱-串联质谱分析运动饮料中甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）等16 种氨基酸的方法。16 种氨基酸在0.10 ～10.00 μmol·L-1线性良好，检出限为0.005 ～0.050 μmol·L-1，定量限为0.03 ～0.20 μmol·L-1，加标回收率为85.1%～96.2%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为1.9%～4.8%。该方法具有前处理简单、灵敏度高和检测速度快的优点，适用于运动饮料中较宽浓度范围内多种氨基酸的同步分析，为其营养价值测定提供参考。尤佳丽等[32]建立了一种SPE-UPLC-MA/MS测定运动型乳饮料中多种氨基酸的方法，样品通过固相萃取小柱净化去除杂质，由超高效液相色谱-四极杆串联质谱法测定，该方法不同加标梯度回收率在85.1%～96.2%，RSD 在1.1%～5.2%，干扰杂质少，提高了检测的准确性和精确性。陈彩云等[33]建立了微波水解-液相色谱串联质谱法（Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，LC-MS）测定保健食品中16 种氨基酸的含量，该方法分析速度快、灵敏度高、准确和重复性好，缩短了样品的前处理时间，可适用于保健食品及功能性食品中16 种氨基酸的快速检测。

2 氨基酸检测方法的展望

越来越多以氨基酸为功能性因子的功能性食品涌现，使氨基酸的研究分析方法显得更加重要。如何研究开发一种快速有效、能同时测定功能性食品中多种氨基酸的检测方法，对于今后功能性食品品质评价及分析评判具有重要意义。氨基酸的分析研究已成为生命、食品、医药等研究领域以及常规的检验检测工作中的重要技术。现阶段色谱法已成为氨基酸检测最为广泛使用的方法，研究方向主要集中在提高稳定性和灵敏度上。而各种检测器的更新换代以及各种分析设备的联用无疑为氨基酸的分析检测提供了更加有力的保障，高分辨质谱、多级串联质谱等技术将会使氨基酸分析的灵敏度、准确度、分析速度及自动化程度均提高到一个新的水平。氨基酸检测方法各有优缺点，今后随着检测技术的发展，其应用范围也会越来越广。可以预见的是色谱技术与各种技术的联用将成为检测的主流，氨基酸的分析速度、灵敏度和重复性将会在未来走上一个新的台阶。由于功能性食品的复杂特性，研发选择性好、准确度高、前处理简便的氨基酸检测方法将是未来的发展趋势。需要注意的是，功能性食品种类繁多，如何选择合适的方法检测其中的氨基酸，还需根据实验条件、样品性质种类、检测灵敏度需求、分析时间长短以及干扰因素等具体判断。