非洲猪瘟病毒截短p54蛋白的原核表达与纯化

伦玉潇，李桂梅,2,3*，单 虎,2,3

(1.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；2.山东省新兽药创制协同创新中心，山东青岛 266109；3.山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心，山东青岛 266109)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性、出血性传染病。目前尚无有效安全的ASF疫苗。ASFV双囊膜结构能适应多种不良环境，感染ASFV的猪可通过分泌物、排泄物等污染环境，健康猪接触被污染的环境可被感染[1]。自然条件下隐性感染ASFV的猪临床症状不明显，只能从血液和组织中检测到ASFV，这种隐性感染可造成更大范围病原传播[2]。

ASFV基因组可编码150个～200个蛋白质，大多与病毒复制、组装、细胞凋亡、免疫功能、炎症反应等有关[3]。p54是ASFV编码的主要结构蛋白之一，在病毒的吸附和侵入过程起重要作用，病毒进入机体后可产生针对该蛋白的抗体，抗体检测阳性即代表存在ASFV感染[4]。p54蛋白有很强的保守性，是良好的ASF血清学诊断靶点[5]。p54蛋白建立的血清学试验方法灵敏性为98%，特异性为97%[6]。健康猪的血清中不存在ASFV特异性抗体，通过特异性抗体检测可筛查出感染ASFV的猪。感染ASFV NH/P68弱毒株后用ELISA在感染早期即可检测到针对p54蛋白的IgG抗体反应，在感染后14 d～39 d期间p54抗体均维持在较高水平[7]。蓝思白2号(LS-2)猪在经过ASFV强毒攻击后约有80%存活,存活猪自感染的第12天起体内的p54抗体水平较高，普通猪感染后10 d内死亡且体内p54抗体水平较低或阴性[8]。p54抗体水平越高，代表机体产生的免疫性越强。因此，p54抗体适于筛查ASFV感染后存活猪或无症状感染猪的检测靶标。

用原核或真核表达系统表达的ASFV重组抗原已成为用活病毒或灭活病毒的抗体检测的重要替代方法。原核表达系统具有成本低、用时短、适于大规模生产的优势。pCold TF载体上的TF标签作为分子伴侣，有助于肽链的正确折叠，并提高蛋白的可溶性。本研究用pCold TF载体表达具有可溶性的ASFV p54重组截短蛋白，探究该蛋白作为包被抗原应用于ASFV抗体检测的可能性，为开发ASFV抗体检测方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体和主要试剂 pCold TF载体、灭活的ASFV阳性血清，由青岛农业大学预防兽医学重点实验室保存；大肠埃希氏菌感受态细胞BL21和DH5α、DNA标准 DL 1 000、限制性核酸内切酶EcoRⅠ和PstⅠ、2×Premix ExTaqDNA聚合酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒、人鼻病毒(Human rhinovirus,HRV) 3C Protease试剂盒、PVDF膜，宝生物工程(大连)有限公司产品；IPTG、磷酸盐缓冲液(PBS)、DNA回收试剂盒、蛋白分子质量标准(11 ku～180 ku)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、4×蛋白上样缓冲液，北京索莱宝科技有限公司产品；HRP标记的山羊抗猪IgG(H+L)、HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)，艾博抗(上海)贸易有限公司产品；质粒小提试剂盒，天根生化科技有限公司产品；His标签蛋白纯化试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司产品；ASFV p54单抗(小鼠)，美国GeneTex公司产品；蛋白分子质量标准(10 ku～180 ku)，山东思科捷生物技术有限公司产品；考马斯亮蓝染色液、蛋白分子质量标准(15 ku～130 ku)、蛋白分子质量标准(10 ku～250 ku)，生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.1.2 仪器和设备 电子天平，上海精天电子仪器有限公司产品；琼脂糖水平电泳槽，北京六一生物科技有限公司产品；PCR扩增仪、电泳仪、小型垂直电泳槽、小型转印槽，美国伯乐公司产品；光凝胶成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司产品；超速低温离心机、电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司产品；超声波细胞破碎仪，上海狄昊实业发展有限公司产品；脱色摇床，江苏其林贝尔仪器制造有限公司产品；紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；超低温冰箱，青岛海尔股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pCold TF-p54的构建 根据GenBank收录的ASFV p54基因片段(Sequence ID：KJ380910.1)，找到51-183位氨基酸相对应的基因序列，交由中美泰和生物技术有限公司合成。以合成的基因为模板并结合pCold TF载体上的酶切位点EcoRⅠ和PstⅠ设计引物以扩增带有酶切位点的截短p54基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳验证条带大小。

上游和下游引物序列分别为:p54-F：5′-TAGAATTCCTATTCTCTTCAAGAAAG-3′(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)；p54-R:5′-TACTGCAGTTACAAGGAGTTTTCTAGG-3′(下划线处为PstⅠ酶切位点)。引物交由青岛派森诺基因科技有限公司合成。PCR扩增体系如下：12.5 μL 2×Premix ExTaqDNA聚合酶，0.5 μL p54-F，0.5 μL p54-R，1 μL 模板，10.5 μL ddH2O。PCR扩增程序为：95℃ 10 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环； 72℃终延伸 10 min。胶回收PCR产物，经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切后连入pCold TF载体，转化至大肠埃希氏菌感受态细胞DH5α中。进行菌液PCR验证，取阳性克隆菌的菌液送青岛派森诺基因科技有限公司测序。测序结果进行blast比对。

1.2.2 p54重组截短蛋白的可溶性表达 将测序结果正确的阳性克隆菌的菌液扩大培养后用质粒小提试剂盒提取重组质粒，并转化到大肠埃希氏菌感受态细胞BL21中。再次经菌液PCR验证后挑取阳性克隆菌落扩大培养。次日以3∶100转接入50 mL含Amp的LB培养液中，于37℃摇床中培养至OD600 nm值为0.6左右时分到各个培养管中，保持每管菌液量相同。根据菌液体积加入1 mol/L IPTG使IPTG终浓度为1 mmol/L，16℃诱导24 h，同时将转化至感受态细胞BL21中的pCold TF空载体菌作为相同诱导条件下的对照，并设置不加入IPTG的未诱导菌液作为阴性对照。24 h后留取30 μL诱导后的重组菌液用于SDS-PAGE上样，将剩下的菌液置于冰浴中超声破碎至菌液由浑浊变为澄清。离心后分离出上清液，再用同等体积预冷的PBS重悬沉淀。在各个未诱导及诱导后的样品中各加入4×蛋白上样缓冲液后煮沸，根据SDS-PAGE凝胶电泳确定蛋白是否可溶性表达。

1.2.3 IPTG诱导浓度与诱导时间的优化 参考用pCold TF载体表达蛋白的已发表文献，可知诱导表达时多选用16℃。因此，将16℃作为诱导温度，在这个基础上优化了IPTG添加浓度及诱导时间。取适量重组菌过夜活化后，隔天进一步扩大培养，当OD600 nm值为0.6左右时将重组菌液分到各个培养管中，使每管含有相同体积的菌液。之后依次分别加入不同体积的1 mol/L IPTG使得IPTG终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mmol/L，16℃诱导24 h。最后根据SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色的结果判断p54重组截短蛋白的表达情况，从而可筛选出最优的IPTG添加浓度。

按照筛选出的最优IPTG诱导浓度添加IPTG后，将重组菌液置于16℃下分别诱导3、6、9、12、21、24 h。最后根据SDS-PAGE凝胶电泳结果筛选出最优的IPTG诱导表达时间。

1.2.4 p54重组截短蛋白的纯化 根据筛选出的最优IPTG诱导浓度和最佳诱导时间，重新诱导重组菌液，离心后收集菌体沉淀。用适量预冷的无菌PBS重悬菌体沉淀，于冰浴下超声破碎，离心后收集上清液。随后依照His标签蛋白纯化试剂盒说明书纯化上清液中的p54重组截短蛋白，同时对咪唑洗脱液所用咪唑的浓度设置了40 mmol/L和50 mmol/L两个梯度，以探究在节约试剂的同时获得较纯p54重组截短蛋白的简易方法。收集纯化过程中的流穿液、洗涤液及洗脱液，通过SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色结果判断p54重组截短蛋白的纯化效果及条带的纯度，并用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的p54重组截短蛋白定量。

1.2.5 切除p54重组截短蛋白的TF标签及切除后的纯化 TF标签的分子质量较大(52 ku)，可能阻碍抗体对p54截短蛋白的识别，为此需将蛋白标签切除。先根据HRV 3C Protease试剂盒的说明构建蛋白标签切除体系，并对HRV 3C Protease的用量进行摸索。向50 μg纯化的p54重组截短蛋白中分别加入2.5、1、0.5 μL HRV 3C Protease后，均加入10 μL HRV 3C Cleavage buffer，并用ddH2O补齐至100 μL。4℃反应16 h后，借助SDS-PAGE凝胶电泳，辅以考马斯亮蓝染色判断TF标签的切除效果。同时用His标签蛋白纯化试剂盒将无标签的p54截短蛋白从构建的切除体系中纯化出来，即收集流穿液。结合SDS-PAGE凝胶电泳结果判断纯化效果。

1.2.6 标签蛋白对p54重组截短蛋白反应原性的影响 用Western blot验证TF标签的有无对于p54单抗识别p54截短蛋白的影响。将经IPTG诱导后的空载体菌作为阴性对照，连同IPTG诱导后的p54重组截短蛋白及标签切除后的p54截短蛋白一起经SDS-PAGE后转印到PVDF膜上，用50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h。选择 ASFV p54单抗(1∶5 000)作为一抗，4℃过夜孵育。隔天加入HRP-山羊抗鼠IgG(1∶6 000)作为二抗，室温孵育1 h，ECL显色。

1.2.7 p54重组截短蛋白的反应原性鉴定 为了验证原核表达的p54重组截短蛋白是否可应用于ASFV抗体的检测，借助Western blot检验该蛋白能否被ASFV抗体阳性猪血清所识别。将IPTG诱导的空载体菌作为阴性对照，连同纯化后的p54重组截短蛋白一起经SDS-PAGE后转印到PVDF膜上，用50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h。加入灭活的ASFV抗体阳性猪血清(1∶200)，4℃过夜孵育。隔天加入HRP-山羊抗猪IgG(1∶2 000)，室温孵育1 h，ECL显色。

2 结果

2.1 截短的p54基因PCR扩增

截短的p54基因的PCR扩增结果与预期相符，大小为421 bp(图1)。将测序结果在NCBI上Blast比对后，结果显示，测序序列与GenBank上ASFV p54基因序列的同源性为99%，且翻译后的氨基酸序列一致，证实了重组质粒pCold TF-p54构建成功。

M.DNA标准DL 1 000；1.样品

2.2 p54重组截短蛋白的可溶性表达

因pCold-TF载体上所带的TF及His标签的融合表达，最终获得的p54重组截短蛋白的预计大小要在截短p54基因编码的蛋白大小的基础上再加52 ku。空载体菌不表达p54重组截短蛋白，而重组菌则表达该蛋白，蛋白的分子质量约为76 ku，与预期相符。比较第5和第6泳道发现相比于沉淀，p54重组截短蛋白更多地分布在菌液裂解后的上清中(图2)，从而证实了该蛋白的可溶性表达。

2.3 IPTG诱导浓度与诱导时间的优化

加入IPTG后p54重组截短蛋白的表达显著增强。通过各个泳道中重组蛋白的表达量可知，当IPTG在重组菌菌液中的终浓度为1 mmol/L(图3)，诱导9 h(图4)时，获得的p54重组截短蛋白产量最高。

M.蛋白分子质量标准(11 ku～180 ku);1～7.IPTG诱导终浓度分别是0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的重组菌

M.蛋白分子质量标准(15 ku～130 ku)；1.未加IPTG的空载体菌；2.加IPTG诱导的空载体菌；3.未加IPTG的重组菌；4～9.加IPTG后分别诱导3、6、9、12、21、24 h的重组菌

2.4 p54重组截短蛋白的纯化

SDS-PAGE的结果表明低浓度40 mmol/L及50 mmol/L咪唑洗脱液即可洗脱p54重组截短蛋白，且50 mmol/L的咪唑洗脱液洗脱的蛋白纯度较好(图5)，从而在节约试剂的同时也简化了对p54重组截短蛋白的纯化。

M.蛋白分子质量标准(10 ku～180 ku)；1～2.流穿液；3～5.洗涤液； 6～7.40 mmol/L咪唑洗脱液；8～9.50 mmol/L咪唑洗脱液；10～14.500 mmol/L咪唑洗脱液

2.5 切除p54重组截短蛋白的TF标签及切除后的纯化

2～4泳道的条带分布表明用2.5、1.0、0.5 μL HRV 3C Protease切除50 μg p54重组截短蛋白，4℃作用16 h的条件下HRV 3C Protease的用量不影响重组蛋白的标签切除效果，因为此时大部分蛋白的标签均可被切除。结合第5泳道的条带可知52 ku的条带是切除的TF及与其相连的His标签，而22 ku的条带是HRV 3C Protease。切除的52 ku的条带较粗，这是因为当TF过表达时可抑制包涵体形成，促使蛋白可溶性表达。第7泳道的条带是纯化后的p54截短蛋白，52 ku及22 ku这两种杂蛋白已被纯化去除(图6)。这是因为所用的HRV 3C Protease的N末端有6×HN(经修饰的His)标签，因此也可用His标签蛋白纯化试剂盒纯化，收集的流穿液即为无标签的p54截短蛋白。证实p54重组截短蛋白上的标签可被切除并可通过纯化去除，最终获得无标签的、高纯度的p54截短蛋白。

2.6 标签蛋白对p54重组截短蛋白反应原性的影响

第1泳道中经IPTG诱导的空载体菌表达的蛋白及第2泳道中切除的TF及His标签不能与ASFV p54单抗结合。而第2和3泳道的76 ku处有明显条带，表明带标签的p54重组截短蛋白能被ASFV p54单抗识别。第2泳道中24 ku处的条带说明ASFV p54单抗也可识别无标签的p54截短蛋白，但不如76 ku处的条带明显(图7)。同时结合第4泳道，无标签的p54截短蛋白的量要比未切除标签的p54重组截短蛋白的量多(图6)，且被切除的His标签一般不影响蛋白的功能，因此可推测TF标签的表达参与加强抗体对p54蛋白的识别，第3泳道的条带也可以证明这一点(图7)。结合以上分析，图7结果证明了原核表达的p54重组截短蛋白及无标签的p54截短蛋白能与特异性抗体结合，具有反应原性，且TF标签的表达有助于抗体对p54截短蛋白的识别，因此建议使用带标签的p54重组截短蛋白。

M.蛋白分子质量标准(10 ku～250 ku)；1.加IPTG诱导后纯化的p54重组截短蛋白；2～4.分别由2.5、1.0、0.5 μL HRV 3C Protease切除50 μg p54重组截短蛋白；5.HRV 3C Protease试剂盒提供带有TF标签的对照融合蛋白切除后标签；6.由HRV 3C Protease试剂盒提供的未切除标签的对照融合蛋白；7.纯化出的无标签p54截短蛋白

M.蛋白分子质量标准(10 ku～250 ku)；1.加IPTG诱导后的空载体菌；2.0.5 μL HRV 3C Protease切除50 μg p54重组截短蛋白；3.加IPTG诱导后纯化的p54重组截短蛋白

2.7 p54重组截短蛋白的反应原性鉴定

第2泳道的76 ku位置处有明显条带(图8)，说明p54重组截短蛋白能被ASFV抗体阳性血清所成功识别，证实了其具有良好的反应原性，可用于血清学抗体检测。

M.蛋白分子质量标准(11 ku～180 ku)；1.加IPTG诱导后的空载体菌；2.加IPTG诱导后纯化的p54重组截短蛋白

3 讨论

本研究采用的pCold TF载体是一种带有His标签及Trigger Factor(TF)可溶性标签的冷休克表达载体，这类载体带有cspA(冷休克蛋白A)启动子及相关元件，使得低温条件下更利于目的蛋白的表达，同时抑制其他细胞蛋白质的表达。实际应用pCold TF载体表达目的蛋白时，多选择15℃或16℃诱导蛋白的表达[9-10]。本研究结果显示在16℃诱导时，p54重组截短蛋白的表达效果良好。TF标签是一种大肠埃希氏菌的具有核糖体结合位点的分子伴侣，促进新生肽链的共翻译正确折叠，也可游离于胞质内辅助翻译后肽链的折叠，从而利于蛋白的可溶性表达[11]。图2显示原核表达的p54重组截短蛋白具有可溶性，这与TF标签的分子伴侣作用有关。先前研究表明p54蛋白的前50个aa中无B细胞表位，且其中大多为疏水性aa[12]。有研究在筛选p54蛋白的B细胞表位时，用ELISA鉴定出p54蛋白的64-70 aa、75-85 aa、103-115 aa为免疫显性区域，能与ASFV阳性血清剧烈反应[13]。因此，理论上去除前50个aa的p54蛋白具有与ASFV阳性血清结合的能力。本研究结果证实了原核表达的p54重组截短蛋白可与ASFV阳性血清反应，具有反应原性。

pCold TF载体上的TF标签序列与多克隆位点区之间有HRV 3C Protease切割位点，可去除TF及与其相连的His标签蛋白。TF标签的缺失表达会加强蛋白的聚集，不利于其天然构象的形成，而TF标签的过表达则有助于有聚集倾向的蛋白转变为功能性蛋白[14]。这为借助pCold TF载体实现外源蛋白的高效率原核表达提供了理论基础。本文的研究结果证实p54重组截短蛋白上的TF标签并不影响抗体对于p54蛋白的识别,这可能是由于TF标签的表达促进了p54蛋白天然构象的形成，从而利于对p54蛋白的识别。另一方面，切除标签并纯化的过程会造成蛋白丢失。综上所述，不建议对p54重组截短蛋白进行TF标签的切除。pCold TF载体在表达兼具可溶性与反应原性的外源蛋白方面具有独特优势，值得重视该载体在原核表达蛋白方面的实际应用。

ASFV的p54蛋白在ASFV免疫学检测方法中得到广泛应用。如基于p54蛋白单克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA及胶体金免疫层析试纸条以检测ASFV抗原[15]。此外，用截短的p54蛋白制成的荧光免疫层析试纸条有助于更直观地检测ASFV抗体[16]。还有研究发现并验证了ASFV p54蛋白中一处非常保守的抗原位点，基于该位点制备单抗并建立了检测ASFV抗体的竞争ELISA法，该方法的特异性可高达100%[17]。利用可识别p54蛋白C端蛋白序列的p54单抗建立了竞争性ELISA方法，其检测灵敏度可达到92.5%，特异性可达到98.9%[18]。结合双重组病毒蛋白p30和p54的双量子点微球探针可以超灵敏地定量检测血清中的ASFV抗体 ，抗体在血清稀释度为1∶1000～1∶64000范围内都可被检测到，且整个抗体筛查试验可在25 min内完成[19]。ASFV免疫学检测方法的建立需要包被抗原或抗体具有可溶性及与相应抗体或抗原结合的能力，本研究表达的p54重组截短蛋白可满足上述要求。

p54蛋白还被应用于疫苗开发中。构建的融合ASFV p54蛋白-猪Ig重链的重组酿酒酵母表达载体疫苗可诱导产生黏膜免疫[20]。用表达ASFV p54和猪IL21融合蛋白的重组植物乳杆菌作为口服疫苗可诱导机体产生细胞和体液免疫[21]。新型细胞穿透肽Z12与ASFV p54和p30蛋白融合后作为亚单位疫苗免疫小鼠后，小鼠的血清在体外中和了超过85%的ASFV[22]。也有多个研究表明pCold TF载体表达的重组蛋白具有免疫原性，可刺激小鼠产生抗血清，抗体效价较高且获得的抗血清与相应抗原间可以发生特异性结合[23-24]。本文因着重于研究pCold TF载体表达的p54重组截短蛋白作为包被抗原使用的可能，并未对其免疫原性进行验证。但不可否认，p54蛋白是诱导机体产生保护性免疫反应的重要免疫原。

本研究用原核表达系统可获得兼具可溶性和反应原性的p54重组截短蛋白，可用于检测ASFV抗体使用。且用原核表达系统极大地缩短了获得p54重组截短蛋白的时间，利于基于此蛋白研制的ASFV抗体检测试剂盒的大规模生产。