牛诺如病毒病研究进展

苗 艳，朱庆贺，钟 鹏，陈 亮，兰世捷，张 蕾，冯万宇，李 丹，沈思思，田秋丰，薛沾枚，刘雪松

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161000)

犊牛腹泻引起的犊牛发病和死亡给世界养牛业造成了巨大经济损失。诺如病毒(Noroviruses，NoVs)是一种在世界范围内引起人急性胃肠炎的重要病原。最初于1968年在俄亥俄州诺沃克的患有肠胃炎的人粪便中发现该病毒，因此诺如病毒原型株被命名为诺沃克病毒(Norwalk virus，NV)[1]。牛诺如病毒(Bovine noroviruse，BNoV)于1976年首次在英国纽伯里腹泻犊牛粪便中发现，该毒株被命名为纽伯里2(Newbury agent 2)[1]。BNoV可能是一种致犊牛肠炎的一种病因，但常规对犊牛腹泻的诊断未将该病毒包含其中，其对犊牛的影响仍不清楚。本文从BNoV的病原学、流行病学、 致病机制和诊断等方面进行综述，为该病的进一步研究提供参考。

1 病原学

1.1 病毒结构

NoVs是一种无囊膜的RNA病毒，为杯状病毒科、诺如病毒属成员。病毒粒子由一个20面体衣壳组成，该衣壳由90个单衣壳蛋白VP1的二聚体组成，形成32个杯形凹陷，诺如病毒外观呈羽毛状。病毒粒子直径为27 nm～35 nm,基因组长度为7.3 kb～7.7 kb，基因组RNA的5′端与基因组连接病毒蛋白(VPg)共价连接，5′端的非翻译区(UTR为5-78位核苷酸)，基因组包含3个开放阅读框(ORF)。ORF1编码非结构蛋白，一种大小约为195 ku的多聚蛋白，该多聚蛋白通过自动催化裂解产生6种非结构蛋白，包括NS1-2(p48)、NS3核苷三磷酸酶、NS4蛋白(p22)、NS5蛋白(VPg)、NS6(3C样蛋白)和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，它们可能在细胞内蛋白质运输、细胞膜运输和形成复制复合物中发挥作用；ORF2编码大小约为60 ku的主要结构蛋白VP1，其包含两个主要结构域，一个保守的壳结构域(S)形成病毒粒子的核心，一个较为可变的突出结构域(P)从中心核向外延伸，P域进一步划分为P1子域和高度可变的P2子域，后者参与与宿主细胞膜的相互作用，拥有最主要的表位。VP1在自组装、衣壳形成、受体识别、宿主特异性、菌株多样性和免疫原性等方面发挥作用。ORF3位于基因组的3′末端，编码一种大小约20 ku的次要结构蛋白VP2，与VP1蛋白的表达稳定性相关，VP2可能参与衣壳组装和基因组衣壳化[2-3]。

1.2 分类

国际病毒分类委员会(International committee on taxonomy of viruses，ICTV)在2002年将杯状病毒科分为4个属，即Vesivirus、Lagovirus、Norovirus和Sapovirus，最近又分出第5个属，暂定名为Nabovirus或Becovirus[4-5]。基于RdRp基因和VP1衣壳基因的保守区域的序列，将诺如病毒进一步细分为基因群和基因型。目前，诺如病毒分为5个基因群，即GⅠ～GⅤ。人诺如病毒位于GⅠ、GⅡ、GⅣ基因群，GⅠ基因群被进一步分为8个基因型，GⅡ基因群被进一步分为19个基因型[6]。牛诺如病毒位于GⅢ基因群[7]，GⅢ基因群分为4个基因型(GⅢ.1～GⅢ.4)，Bo/Jena/80/DE和Bo/Newbury2/76/UK毒株分别为GⅢ.1和GⅢ.2的2个原型毒株，其中GⅢ.2在世界范围内分布最为普遍。Wolf等在新西兰猪和羊粪便样本中发现了与牛GⅢ型诺如病毒密切相关的诺如病毒，可能代表了第3个GⅢ基因型[8]。此外，鼠诺如病毒位于GⅤ基因群，猪诺如病毒位于GⅡ基因群，狮子、猫和狗诺如病毒位于GⅣ基因群[7]。还有报道提出了另外2个基因群，即GⅥ和GⅦ基因群[9-10]。此外，还有文献报道了几种新型诺如病毒，基因群总数增加到10个(GⅠ～GⅩ)，基因型增加到49个，即GⅠ基因群9个、GⅡ基因群27个、GⅢ基因群3个、GⅣ～GⅥ基因群各2个、GVⅡ～GⅩ基因群各1个[4]。

1.3 理化特性

诺如病毒在氯化铯(CsCl)中的浮力密度为1.33/cm3～1.41g/cm3。诺如病毒在环境中可保持数周的传染性，并能抵抗高达60℃的高温和用于饮用水消毒的10 mL/L氯化消毒。通过非电离辐射(UV辐射)和电离辐射(γ辐射)可使诺如病毒失活。通过乙醇、高温、改变pH、较高的氯浓度以及脉冲光处理可降低病毒滴度[11-12]。

2 流行病学

流行病学研究表明，NoVs在世界范围内广泛存在，人、牛、猪和小鼠常感染该病毒。BNoV的相关研究较少，该病毒对牛的致病性尚不清楚。在世界多个大洲国家的牛中均检测到BNoV，如亚洲[13]、欧洲[14]、非洲[15]、美洲[16]、大洋洲[17]的一些国家，包括韩国、美国、埃及、乌拉圭、澳大利亚等国家。目前，对该病毒的大规模流行病学调查较少，BNoV的感染情况在各项研究中的差异较大。英国兽医实验室局(Veterinary laboratories agency，VLA)和皇家兽医学院(Royal veterinary college，RVC)进行了一项合作研究，以确定BNoV在腹泻牛中的流行情况。RVC通过RT-PCR对VLA提供的398份牛腹泻样品进行BNoV的检测，结果显示BNoV的阳性率为11%(44/398)[18]。但在对美国俄亥俄州的一项研究中，所检测的粪便样品中BNoV阳性率则高达72%[14]。此外，用RT-PCR方法对美国密歇根州和威斯康星州奶牛场犊牛腹泻粪便样本中诺如病毒的存在进行了调查，结果显示密歇根州和威斯康星州的NoV阳性率分别为80%和25%[19]。以上研究结果表明，NoV感染率的高低可能与多种因素相关，包括地域的不同、牛场和饲养环境的不同、牛的品种等因素。我国对BNoV的研究较少，缺乏大规模的流行病调查，2017年第1次在牛粪便样品中检测到牛诺如病毒[20]。对河南部分地区的牛腹泻病料进行BNoV的PCR检测[21]，结果显示BNoV的检出率为11.41%(21/184)。对我国6省份的25个养殖场采集的211份腹泻牛粪便样本进行检测，BNoV的阳性率为20.5%，表明BNoV在我国也有较高的流行率[22]。但目前还无法确定BNoV是否可以作为引起腹泻的原发病原或合并感染的主要病原。对埃及2个农场进行的研究中发现[23]，在4%的腹泻犊牛样本中唯一检测到的病原体是BNoV，20%的样本中还检测到其他病原。然而,该研究仅对BRoV、 BAstV、BNoV、BCoV、 BToV和 BVDV共6种病毒病原进行了检测，未对细菌和寄生虫病原进行调查，因此无法确定BNoV是引起犊牛腹泻的主要病原体。但有研究以GⅢ型 BNoV感染无菌犊牛[24]，结果无菌犊牛表现出厌食和水样腹泻症状，并伴有肠上皮坏死和绒毛萎缩。然而，目前证明BNoV是犊牛腹泻的重要病原的证据仍有限。BNoV在健康犊牛中的潜在高流行率以及健康犊牛和腹泻犊牛之间的病毒的排放量之间没有显著差异。用RT-qPCR方法对761份牛粪便或肠道内容物进行分析，BNoV总检出率为66.1%，在腹泻型和非腹泻型犊牛样品中BoNoV的检出率相似，分别为78.8%和76.2%[16]。通过RT-qPCR对419份腹泻和非腹泻犊牛粪便样品进行BNoV检测，结果在腹泻和非腹泻样本中，BNoV的总体流行率无显著差异[25]。表明BNoV的临床相关性较有限，可能无法作为一种致腹泻的主要病原体。BNoV在某些情况下作为唯一的感染因子或作为共同感染因子是否具有致病性目前尚不清楚。因此，BNoV与犊牛腹泻之间的明确因果关系仍有待确定。

3 临床特征和致病机制

腹泻是感染BNoV的最主要临床症状，此外还可能伴有呕吐、短暂性厌食、精神沉郁和消化不良综合征等症状。研究显示，感染Bo/Jena/80/DE和 Bo/Newbury2/76/UK毒株犊牛的组织病理学损伤包括近端小肠黏膜下层的绒毛萎缩、隐窝增生和水肿，胃黏膜和直肠黏膜无损伤；感染CV186-OH/00/US毒株的犊牛表现为急性腹泻，粪便排毒延长，但无明显的肠道损伤[2]。目前对BNoV的致病机制尚不清楚，但从其他物种的诺如病毒特别是从人诺如病毒上推断，BNoV可以通过粪-口途径进行传播，通过受污染的食物或饮水进行传播；另一种自然感染途径可能是通过呕吐物中的气溶胶颗粒进入呼吸道。诺如病毒具有高度感染性，约20个病毒粒子即可引起感染，通常在最初临床症状之前或期间可检测到排放的病毒粒子。NoVs一年四季均可感染，但通常有季节性，表现为冬季多发。与其他肠道病毒(如轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒等)混合感染可能会影响诺如病毒感染的严重程度。

4 诊断

常规电镜和免疫电镜检测方法由于检测灵敏度相对较低，不足以用于常规诊断，已逐步被分子检测方法取代。通常用RT-PCR或RT-qPCR对诺如病毒进行检测。常用的引物可以检测到诺如病毒属的所有分离物，也可用特异性引物对诺如病毒所属基因群进行检测和确定。在疫情暴发的情况下，可以对RT-PCR产物进行测序，从而揭示感染病毒的遗传进化关系。多数检测诺如病毒的RT-PCR引物都是根据RdRp基因末端高度保守区域、ORF2基因起始区域和NS3编码序列进行设计的[2,21]。使用不同的引物组合可对病毒完整的基因组进行测定。新的分子技术，如二代测序、宏基因组测序等已开发用于诺如病毒的检测和分析[26]。ELISA方法可用于对粪便样本进行抗原检测、对血清样品进行抗体检测。但抗原ELISA相对RT-PCR或RT-qPCR敏感性和特异性较低，可能对于低成本、高通量筛选多种粪便样品中的诺如病毒有一定价值。不同模式的抗体ELISA检测方法已被开发用于评估人和动物诺如病毒的血清流行情况。抗体ELISA较抗原ELISA具有更广泛的活性，且在遗传关系密切的毒株之间很难区分异源反应。因此，不能通过抗体ELISA来确定是否感染某种特定毒株。因目前还无法对诺如病毒进行体外培养，因此对其血清学检测方法的开发是一种障碍，但有研究人员通过杆状病毒表达系统表达并组装成与感染性病毒颗粒具有相似形态结构和抗原性的VLP，以其作为病毒抗原进行抗原/抗体ELISA检测[27]。

5 基因重组和种间传播

RNA重组是病毒进化的重要驱动力，重组可能会导致病毒毒力增强，或产生具有未知致病潜力的新毒株。随着对诺如病毒属重组病毒认识的增加，诺如病毒重组病毒的鉴定也越来越多，重组点多位于ORF1和ORF2连接区。诺如病毒遗传变异性较高，常发生基因重组，目前已发现两种重组的BNoV：GⅢ.P1/GⅢ.2和GⅢ.P2/GⅢ.1，重组点位于ORF1/ORF2连接起始点上游的16-19位核苷酸。有研究鉴定了第1株重组BNoV毒株Bo/Thirsk10/00/UK，该毒株具有与GⅢ.1相关的RdRp序列和与GⅢ.2相关的衣壳编码序列，随后，在比利时、挪威和意大利都发现了GⅢ.P1/GⅢ.2重组毒株[2]。但目前仅鉴定出了1株具有与GⅢ.2相关的RdRp序列和与GⅢ.1相关的衣壳编码序列的重组BNoV毒株，即B-1SVD/03/US[28]。目前关于BNoV重组毒株的鉴定和研究较少，无法确定上述2种重组BNoV毒株哪种占优势或流行范围较广。

人诺如病毒是全球食源性胃肠炎的主要原因。NoVs可感染多种动物，尚不清楚动物诺如病毒对人诺如病的发病是否存在一定作用。分子生物学分析结果表明，动物和人诺如病毒毒株密切相关，尤其是猪诺如病毒，它们与一些人诺如病毒毒株属于同一基因组(GⅡ)[2]。英国学者对诺如病毒的人畜共患可能性进行了定性风险评估，将BNoVs归类为0级(在4级之前不存在人畜共患病)[29]。有研究以Gn犊牛为动物模型研究人诺如病毒(GⅡ.4-HS66)致病机制和宿主免疫应答[30]，结果显示，感染了含有人粪便悬浮液的犊牛会发生轻度腹泻，病毒在肠细胞中的复制可能伴随着病毒的排放，近端小肠的病变与Newbury agent 2的病变相似，但程度较轻，这表明NoV可能在人与动物之间进行传播。目前尚未在人粪便样本中检测到动物诺如病毒，但人与动物诺如病毒可能在某些条件或环境下混合存在，这就为动物诺如病毒和人诺如病毒的重组提供了有利条件。重组是否会产生新的能够在人和动物之间传播的诺如病毒仍未知，目前还无法排除诺如病毒的人畜共患传播可能。人感染诺如病毒主要是通过受污染的食物或饮水以及人与人之间的传播，是否可能通过动物源性食物或与患病动物接触传播仍不确定。

6 小结与展望

诺如病毒属包含可感染人、猪、牛和小鼠等多种动物的诺如病毒，因此存在人畜共患传播的可能。通常，人畜共患病的传播可以通过食物链间接发生，也可以通过动物接触直接发生。将动物病毒传播给人类可能会产生更严重的感染，如高致病性禽流感病毒(H5N1)、严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒。如果诺如病毒具有人畜共患病传播潜力，那么监测新出现的病毒株并追踪其毒力特征对于限制病毒传播至关重要。目前尚无特定的抗诺如病毒治疗药物和疫苗，人和动物诺如病毒的相关研究都面临着重大挑战。NOV的遗传多样性，新的突变体和重组体的周期性出现，对相关保护的知识有限，缺乏培养病毒的有效细胞系，以及缺乏易于使用和合适的动物模型，这些问题给诺如病毒的进一步研究都带来巨大困难。BNoV作为肠道病原体的作用已在犊牛中得到证实，应在犊牛腹泻的鉴别诊断中对该病毒予以考虑。