云南八倍体割手密84-268血缘F2群体表型多样性分析

俞华先，安汝东，董立华，桃联安，刘家勇，田春艳，经艳芬，郎荣斌，边 芯，周清明，孙有芳，张 钰

云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽育种站，云南瑞丽 678600

割手密（Saccharum spontaneumL.）即甘蔗细茎野生种，又名甜根子草、小巴茅，是禾本科（Gramineae）蜀黍族（Andropogoneae）甘蔗属（Saccharum）及其近缘属植物中一个最有研究价值和育种价值的野生种[1]。现代甘蔗品种几乎都含有割手密的血缘，其血缘占现代甘蔗品种血缘的 10%~20%[2-3]。割手密在甘蔗属的野生种中分布最广，基因型变异较丰富，具有抗逆性强、适应性广、强宿根性、较高糖分等特性，最早被用于高贵化育种，是拓宽甘蔗遗传基础最有利用价值的野生种质资源[4]。中国既是割手密的原产地之一，也是割手密重要的多样性分布中心之一[5]。我国割手密主要分布在北纬 18°15′~33°20′、东经97°~122°，海拔 1~2460 m[6]，据陈辉等[7]和范源红等[8]的研究结果，云南省可能是割手密资源的重要起源中心。割手密是染色体数极其复杂的多倍体植物，染色体数（2n）介于40~128之间，染色体以 8为基数，其中 2n=64、80、96、112和128等 5种染色体类型最多[9]。蔡青等[10]以国家甘蔗种质资源圃保育的247份割手密开展染色体类型研究，结果发现整倍体割手密主要有5种，依次是八倍体（2n=64）、九倍体（2n=72）、十倍体（2n=80）、十二倍体（2n=96）、十三倍体（2n=104），其中材料数以2n=80（十倍体）最多，其次为2n=64（八倍体）。陈如凯[11]研究认为与“甘蔗属复合体”的野生种相比，割手密与甘蔗栽培原种或品种杂交，染色体的亲和力和重组率高，后代具有较好的抗逆性、适应性、分蘖力、长势等特性。

回顾世界各个国家的甘蔗育种史，可发现整倍体割手密对世界甘蔗产业的发展起着重要作用，如利用十四倍体的爪哇割手密（2n=112）、八倍体的印度割手密（2n=64）所育成的POJ2878、Co281、Co290和Co213等重要亲本，极大程度地改良了甘蔗品种的产量、糖分及抗性[12-13]。20世纪中期，中国海南甘蔗育种场基于崖城割手密（2n=64，八倍体）创制了一系列崖城亲本，并基于这些亲本选育出 32个品种，大大推动了中国甘蔗产业的快速发展[14]。鉴于整倍体割手密资源对于甘蔗品种改良的重要性，前人对中国保育的整倍体割手密资源开展了大量研究。刘新龙等[9]2012年对171份中国十倍体割手密资源表型性状的表型相关性及遗传多样性进行评价，研究结果为十倍体割手密资源的利用提供了重要的参考依据；李旭娟等[15]2014年对中国保育的50份十倍体割手密抗逆功能标记的遗传多样性进行研究，结果发现十倍体割手密在抗旱功能标记方面表现出更为丰富的遗传变异；刘新龙等[16]2014年对国家甘蔗种质资源圃保育的 30份云南八倍体割手密资源进行产量和品质性状相关性和聚类分析，研究结果表明云南八倍体割手密资源产量性状的遗传变异较品质性状丰富；李旭娟等[17]2015年对国家甘蔗种质资源圃保育的 30份云南八倍体割手密资源的抗逆功能标记遗传多样性进行了探讨，研究发现八倍体割手密中还有很多抗逆血缘未渗透到现代甘蔗品种中；刘新龙等[5]2017年对62份不同倍性的割手密的遗传多样性及抗病分蘖基因多态性展开研究，结果发现八倍体和十倍体割手密在形态、品质性状和基因组水平上拥有更为丰富的遗传变异，并且具有较大的潜力可挖掘；近年来，云南省农业科学院甘蔗研究所利用内陆型的云南蛮耗割手密（2n=80），创制了一系列云瑞亲本[18-19]。另外我国的甘蔗种质资源圃也保育了大量的整倍型割手密，由于对它们所具备的优异特性、遗传背景和评价利用研究较少，致使其优异的性状或优异基因开发利用率不高。八倍体割手密是我国倍数较低的整倍体割手密，其杂交一、二代（F1、F2）的创新种质，是甘蔗有性杂交育种中云南八倍体割手密优良基因世代升级的遗传载体，亦是云南八倍体割手密在利用过程中克服细茎、低糖和早花等不利野生性状，保留其广适应性、强宿根性和抗逆性的重要途径，对其F2创新种质开展表型性状的多样性研究是甘蔗优良品种选育的基础。云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽甘蔗育种站（国家内陆甘蔗杂交育种站）课题组一直致力于利用云南割手密创新种质、培育创新亲本、改良甘蔗品种抗逆性的研究[20-27]，在2018/2019杂交季节创制了云南八倍体割手密84-268的F2群体材料，目前针对该群体资源的遗传多样性的评价研究还是空白，极大限制了该类资源在甘蔗品种改良中的利用，鉴于此，本研究针对该群体的100份种质材料的倍性性状进行评价、鉴定、筛选和分类，为下一步对该群体的创新利用及优异基因挖掘提供重要指导。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为云瑞新创制优良亲本云瑞06-1598（白楼蔗×51NG90）与云南八倍体割手密血缘F1优良种质云瑞14-258（云瑞09-163×云南84-268）杂交所创制的云南割手密F2群体材料，共计208个杂交单株，通过SSR标记鉴定真假杂种和剔除病死单株，最终获得1个包含100个杂交后代材料的云南八倍体割手密F2群体，由于该新群体组合号为 226号，对其重新编号为云割F218-226-1至云割F218-226-100。

1.2 试验设计

试验布置在东经 97°51′44″、北纬 24°1′33″，海拔778.6 m的云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽育种站内，该试验地光温资源丰富，年均温20℃，年降雨量1394 mm，属于南亚热带季风性湿润蔗区。试验地前作为甘蔗，土壤为沙壤土，肥力均匀。于2018年3月上旬完成试验材料实生苗播种，4月中旬假植，5月下旬完成大田定植。试验采用随机区组设计，设3个重复。小区面积7.2 m2，小区行长6 m，行距1.2 m，田间管理与大田生产一致。

1.3 测定项目与方法

分别于2018年11月中旬和2019年11月下旬，大田收集每行成活丛数、茎径、有效茎数（大于1 m的蔗茎）、锤度、株高和茎径等农艺性状的新植和宿根数据，其中株高、茎径和锤度每丛随机选取3株进行调查，选用2018、2019年1月中旬的新植、宿根锤度，参照经艳芬等[28]的方法利用以下公式计算单茎重、单产和11月理论糖产量，参试农艺性状的指标取新植、宿根平均值。

单茎重（kg）=（株高-50）×茎径2×0.785/1000

单产（t/hm2）=茎径2×（株高-50）×0.785×丛有效茎数×10-6

糖产量（t/hm2）=单产×11月份理论蔗糖分/100

式中，株高、茎径单位为cm，丛有效茎数为每公顷有效茎数（条/hm2），理论蔗糖分单位为%。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2019软件整理各农艺性状指标的原始数据，采用 SPSS22软件计算各农艺性状的平均值、标准差、变异系数并制作频数分布图，利用DPS 13.5数据处理系统进行逐步回归分析、主成分分析和判别分析，利用 RStudio的软件包进行相关分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 7个主要农艺性状的种质频数分布

云南八倍体割手密84-268血缘F2创新种质材料主要农艺性状的频数分布见图1~图4。从图1~图4可知，该群体的7个主要农艺性状频数分布呈现较好的正态分布。不同性状的频数分布峰值与Y轴的距离有差异，数据分布范围较广，表明这100份云南八倍体割手密84-268血缘F2创新种质材料确实存在广泛的遗传多样性。

图1 株高和茎径频率分布直方图Fig.1 Histogram of frequency distribution of plant height and stalk diameter

图4 糖产量频率分布直方图Fig.4 Histogram of frequency distribution of sugar yield

图2 锤度和单茎重频率分布直方图Fig.2 Histogram of frequency distribution of brix and single stalk weight

图3 有效茎数和蔗茎产量频率分布直方图Fig.3 Histogram of frequency distribution of effective stem number and cane yield

2.2 主要农艺性状的遗传多样性分析

由表1可见，云南八倍体割手密84-268血缘F2创新种质材料7个农艺性状间的变异系数分布幅度比较大，范围为9.91%~50.76%，其中变异系数最大的是糖产量达到 50.76%，变幅为 2.94~32.45 t/hm2，其次是蔗茎产量的变异系数最大，达到50.03%，变幅为19.08~181.98 t/hm2，由此说明，这 100份云南八倍体割手密 84-268血缘 F2创新种质材料的糖产量和蔗茎产量遗传变异最为丰富。因此，在云南割手密创新种质材料的选择利用上要重点考虑糖分和产量；有效茎数、单茎重、茎径、株高和锤度的变异系数依次为37.25%、32.13%、13.75%、10.75%和9.91%，其变幅依次为 27 274.09~272 740.91条/hm2、0.21~1.09 kg、1.29~2.43 cm、134~255 cm和12.60~20.80%。孙铭等[29]研究认为变异系数大于 10%表示样本间差异较大，本研究中7个主要农艺性状的变异系数除锤度的变异系数为 9.91%外，其余性状变异系数均大于10%，说明该群体材料性状分离明显、变异丰富，存在可利用的特异性种质材料。

表1 云南八倍体割手密84-268血缘F2群体的农艺性状表现Tab.1 Performance of agronomic traits of Saccharum spontaneum L.F2 population in Yunnan

2.3 7个农艺性状的相关性分析

由图5的相关性分析可见，株高、茎径与单茎重呈极显著正相关，蔗茎产量、蔗糖产量与株高、茎径、单茎重和有效茎数呈极显著正相关，蔗茎产量与锤度呈负相关，蔗茎产量与糖产量呈极显著正相关。由此可知，各农艺性状指标之间存在显著相关性，7项指标间是相互影响、相互制约的，若直接利用这些指标进行群体创新材料的评价会产生信息重叠，为了科学客观地利用云南八倍体割手密 84-268血缘 F2群体创新材料农艺性状指标，有必要对其降维处理。

图5 群体参试材料农艺性状的相关性分析Fig.5 Correlation analysis of agronomic traits in the tested materials

2.4 蔗茎产量和糖产量的逐步回归分析

分别以蔗茎产量（y1）和糖产量（y2）为因变量，以株高（x1）、茎径（x2）、锤度（x3）、单茎重（x4）、有效茎数（x5）为自变量进行多元逐步线性回归分析，分别得到回归方程：

y1=-278.4781+0.4721x1+132.7984x2-98.0620x4+0.0005x5

y2=-52.6577+0.0692x1+19.3600x2+0.6289x3-11.6935x4+0.0001x5

方程的决定系数依次分别为R1=0.9282和R2=0.9160。从回归方程可以看出，蔗茎产量主要由株高、茎径、单茎重和有效茎数4个因素决定，糖产量有株高、茎径、锤度、单茎重和有效茎数5个因素决定。

2.5 主成分分析

对该群体的7个主要农艺性状进行主成分分析（表2），根据主成分分析的原理，结合特征值≥1的原则或主成分累积方差贡献率应≥85%的标准[30-31]，取前3个特征值作为100份云南八倍体割手密 84-268血缘 F2群体材料的主成分。从表2可以看出，选取的前3个主成分的累计贡献率为86.985%，特征向量总和为6.089，概括了该群体的绝大部分信息。主成分 1的特征值为3.333，贡献率为47.615%，此主成分特征向量中，糖产量和蔗茎产量的特征向量最大依次分别为0.519和 0.511，其次是单茎重（0.410）和茎径（0.368），因此把主成分 1称为糖分产量因子。主成分2的特征值为1.718，贡献率为24.545%，此主成分特征向量中，有效茎数向量值最大为0.587，其次是糖产量和锤度分别为 0.244和0.232，因此把主成分2称为茎数因子。主成分3的特征值为1.038，贡献率为14.824%，此主成分特征向量中，锤度的向量值最大为0.831，其次是株高（0.476）和单茎重（0.096），因此把主成分3称为锤度株型因子。参照陆鑫等[32]、田江等[33]和俞华先等[34]的方法计算主成分得分系数矩阵（表3）。根据主成分计算公式，得到3个主成分与7项农艺性状的线性方程组合：

表2 群体参试材料的特征值、贡献率和累积贡献率Tab.2 Eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates of the tested materials

表3 主成分及其得分系数矩阵Tab.3 Matrix of principal components and their scoring coefficients

W1=0.077X1+0.111X2+0.000X3+0.123X4+0.094X5+0.156X6+0.153X7

W2=-0.053X1-0.293X2+0.315X3-0.287X4+0.342X5+0.113X6+0.142X7

W3=0.458X1-0.081X2+0.801X3+0.092X4-0.199X5-0.146X6+0.024X7

式中，W表示主成分得分，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7分别表示经标准化处理后的株高、茎径、有效茎数、单茎重、锤度、蔗茎产量、糖产量数值。将7个农艺性状数值代入以上公式即可得到主成分得分（表4）。

参照张军科等[35]的方法，利用数学模型：S=b1y1+b2y2+…+bnyn（S表示综合得分值；bn为第n个主成分对应的方差贡献率；yn为第n个主成分的得分），求 100份创新材料农艺性状综合得分，并把农艺性状综合得分值依次降序排列（表4），由表4可知，100份云南八倍体割手密84-268血缘F2群体材料7个农艺性状综合评价得分依次为：云割 F218-226-7＞云割 F218-226-14＞云割F218-226-89＞ 云 割 F218-226-48＞......＞ 云 割F218-226-58。

表4 主成分得分及其综合得分Tab.4 Scores of principal components and their comprehensive scores

续表4 主成分得分及其综合得分Tab.4 Scores of principal components and their comprehensive scores (continued)

续表4 主成分得分及其综合得分Tab.4 Scores of principal components and their comprehensive scores (continued)

2.6 聚类分析

根据主成分的分析结果，利用R语言软件，对100份云南八倍体割手密84-268血缘F2群体材料7个农艺性状的综合评价得分值进行标准化转换，以欧氏距离、可变类平均法对种质进行系统聚类分析。由图6和表5可知，在欧氏距离6.00处，可将100份种质资源分为3个大类群，第Ⅰ类包括云割F218-226-7、云割F218-226-14、云割F218-226-4和云割F218-226-17等33份创新材料，占总材料的33.00%，该类材料植株高大、中茎，平均锤度最高，有效茎数最多，蔗茎产量和糖产量最高，可以考虑重点加强利用；第Ⅱ类包括云割 F218-226-76、云割 F218-226-47、云割F218-226-80、云割F218-226-75和云割F218-226-63等29份材料，占总材料的29.00%，7个农艺性状变异系数均大于 8.10%，该类材料中大茎、蔗茎产量和糖产量的变异系数最大，田间表现为高产高糖，要选择性利用。第Ⅲ类包括云割F218-226-33、云割 F218-226-25、和云割F218-226-24等38份材料，占总材料的38.00%，其变异系数锤度为10.34%，其余性状的变异系数均大于11.00%，其余农艺性状的变异系数变幅在11.24~35.67%，这些材料表现为植株高大、中茎，蔗茎产量和糖分不很理想，可以考虑选择性利用或者淘汰。

表5 3个聚类群及其性状特征Tab.5 Three Cluster groups and their characteristics

图6 基于7个农艺性状综合评价得分值的聚类图Fig.6 Dendrogram of Cluster diagram based on the score values of the comprehensive evaluation of 7 agronomic traits

为了判断聚类结果是否可靠，采用多类逐步判别法对其进行判别（表6）。结果表明，第Ⅰ类群判对概率为 78.79%，第Ⅱ类群判对概率为89.66%，第Ⅲ类判对概率为97.37%，根据判别分析原理可知，判别概率越高，证明种质被正确分类的机率越大。从表6可以看出，每个种质被正确分类的概率较高，平均判对概率为88.61%。

表6 判别分析矩阵Tab.6 Lists of discriminant analysis matrices

3 讨论

遗传多样性是生物多样性的重要内容之一,也是生物所携带遗传信息的总和，研究生物遗传多样性具有重要的理论和实际意义[36]。尽管现代分子生物学手段为种质资源的研究提供了稳定有效的方法，但对于表型性状的调查和分析仍不可缺少，尤其对于云南野生割手密的鉴定和创新利用，表型农艺性状的评价尤为重要。割手密倍性遗传多样性的分析是割手密种质资源保育和育种方案设计的前提，甘蔗种质资源的遗传多样性是其育种工作的基础[37]，充分挖掘云南八倍体割手密农艺性状的遗传变异和遗传背景，可以为甘蔗育种工作提供理论基础。遗传变异系数是种质间遗传变异性状差异的一种标志[38]，也是遗传变异潜力大小的标志，表示群体中直接选择的范围。刘建乐等[39]认为变异系数大的性状，从该群体中选出具有该性状的优良个体的几率大，反之则小。本研究发现100份云南八倍体割手密84-268血缘F2群体材料具有丰富的遗传变异性，7个农艺性状除锤度的变异系数为9.91外，其余性状的变异系数均大于10%，其中糖产量的变异系数最大为50.76%，其次是蔗茎产量变异系数为50.03%，锤度的变异系数最小为9.91%。齐永文等[40]对64份广东割手密资源农艺性状遗传多样性评价中，其株高、茎径、锤度的变异系数远远低于本研究结果，这可能是其实验材料来源地都是广东地区，遗传距离接近所致；张革民等[41-42]在 2006年对94份割手密主要数量性状的主成分及聚类分析及2007年对 21份广西高糖割手密无性系遗传多样性的表型和PAPD进行的分析中，株高、茎径、锤度和蔗茎产量等表型性状的变异系数与本研究结果近似。另外，本研究中单茎重的变异系数为32.13%，与刘新龙等[16]在对 30份云南八倍体割手密的6个产量性状和3个品质性状研究中单茎重的变异系数达到60.70%不一致，其原因可能是本研究的试验材料是同一个无性系，以及不同评价体系所造成。

相关性分析表明，株高、茎径分别与单茎重、蔗茎产量、蔗糖产量呈极显著正相关；单茎重与蔗茎产量、蔗糖产量均呈极显著正相关，蔗茎产量与蔗糖产量呈极显著正相关；糖分相关性状如修正锤度与蔗糖分呈极显著正相关等结论与张革民等[41]、刘新龙等[16]、齐永文等[40]和俞华先等[43]的研究结果基本一致。此外，本研究群体材料是特定的云南八倍体割手密杂交F2群体，在相关性分析中，株高与蔗糖产量呈极显著正相关，蔗茎产量与蔗糖产量呈极显著正相关，与赵俊等[44]对113个国外甘蔗种质13个工农艺性状的相关性相关分析的结论一致；有效茎数与蔗茎产量和糖含量呈极显著正相关，与陆鑫等[45]、秦昌鲜等[46]的研究结果一致；其中有效茎数与茎径呈负相关，与生产实践相吻合。在对100份云南八倍体割手密84-268血缘F2群体材料的7个性状的回归分析表明，对高产高糖甘蔗种质的选育中，株高、茎径、锤度和有效茎数是要重点考察的关键性状，该结论与徐志军等[47]对209个甘蔗F1群体材料8个性状的回归分析和吴建涛等[48]对10个粤糖系列甘蔗产量与产量构成因子多元回归分析结论一致。

云南八倍体割手密84-268血缘F2群体材料的农艺性状大多数受微效多基因控制，结合本研究的相关性分析可知，不同农艺性状间存在不同程度的相关性，即其中某一性状的改变会导致其他性状的改变，郭元元等[49]认为在育种中改良重要性状的同时也会引起次要性状的改变。赵俊等[44]、秦昌鲜等[46]和俞华先等[50]研究认为甘蔗各农艺性状指标间存在相互联系、相互制约关系，各农艺性状在大田生产中的综合信息容易出现交叉重叠，若直接用这些性状进行分析评价，结果会存在较大误差，为了科学评价参试材料，本研究采用主成分分析法对原始数据进行降维处理。

主成分分析作为一种多元统计分析技术，其各主成分之间就是一个独立系统，数值直观、容易分析，且可以简化资源筛评、价选的程序。朱东旭等[51]、唐启明等[52]认为，主成分分析法有利于提高育种水平和多目标育种的亲本选配效率。本研究将7个性状简化为3个主成分即糖分产量因子、茎数因子和株型因子，累积贡献率为86.985%，说明这3个主成分反映了100份云南八倍体割手密血缘F2的7个农艺性状的绝大部分信息，与张革民等[42]、秦昌鲜等[46]的研究结果存在差异，可能与甘蔗的血缘基础和所分析的农艺性状不同有关。

在主成分分析的基础上进行聚类分析，可有效剔除一些不重要的重叠信息，减少统计分析的复杂性，使得分析结果更加客观科学。闫世江等[53]认为聚类分析结果可为育种决策提供有价值的参考依据。本研究基于 100份云南八倍体割手密84-268血缘F2群体材料7个农艺性状的综合评价得分值进行系统聚类，将100份材料分成各具特征的三大类群，为了判断聚类结果是否可靠，采用多类逐步判别法对其进行判别，其平均判对概率为88.61%，较科学客观地反应出该群体材料基因型分离的差异性与相似性特点，在以后的高产高糖材料育种或研究中，可以利用该系统聚类图结合育种目标选择高糖、高产和高抗类型的极端材料，从而提高育种或研究效率。

本研究仅针对 100份云南八倍体割手密84-268血缘F2群体创新种质材料的 7个表型性状进行了分析评价，毕竟所研究的表型农艺性状有限且受到环境的影响较大，因此下一步还有待于从分子生物学角度进一步对这些资源进行研究，以期更加客观地评价云南八倍体割手密种质资源特性，促进割手密优质种质资源的高效创新利用。