氧敏感膜聚合物基质材料对荧光猝灭性能的影响研究

王智文 屈发进 赵雅文 汪岩屹 陈初升*

1（中国科学技术大学材料科学与工程系，合肥230026）2（中国科学技术大学先进技术研究院，合肥 230031）

氧气是维持生物生命活动的重要物质，也是工农业生产的重要原料。及时准确地检测气态氧气或液相溶解氧浓度对于人们的生产和生活均具有重要的实际意义[1]。光学氧传感技术是一种基于荧光猝灭原理的传感技术，具有高灵敏度、快速响应时间、不消耗氧气和过程可逆等优点，在各领域中得到越来越广泛的应用[2]。

荧光是一种光致发光现象，处于基态的荧光指示剂分子（M）吸收特定波长的入射光能量后，进入具有振动能级的激发态（M*），激发态返回基态发射荧光，发射过程如式（1）和（2）所示。荧光发射过程中，荧光分子与其它分子发生作用而出现的光强度降低、发光时间缩短的现象称为荧光猝灭。氧气是最常见的荧光猝灭剂，能量较低的三线态氧分子（O23）能够吸收激发态的荧光指示剂分子能量，发生荧光动态猝灭（式（3））[3-4]。

荧光氧传感器是一种基于氧气的荧光猝灭原理的传感器，其荧光强度或寿命与氧浓度之间的定量关系遵循Stern-Volmer（SV）方程（式（4））[5]：

式中，I0和τ0分别为完全无氧状态下的荧光强度和寿命，I和τ为存在氧气环境下的荧光强度和寿命，[O2]为氧浓度或者氧分压，Ksv为Stern-Volmer 猝灭常数。

氧敏感膜是荧光氧传感器的核心组成部分，通常采用聚合物作为基质，在其中分散荧光指示剂制备而成[6]。四（五氟苯基）卟吩铂（PtTFPP）具有高荧光量子产率、长荧光寿命、大斯托克斯位移和良好的光化学稳定性等优点，是理想的荧光指示剂[7-8]。基质材料的氧气渗透性在氧敏感膜中起重要作用，影响传感器的灵敏度、精确性和响应时间等参数。聚氯乙烯（PVC）、聚苯乙烯（PS）和乙基纤维素（EC）等聚合物具有高透光率、环保无毒和低成本等特点，因此常作为荧光氧传感器敏感膜的基质使用。

通过荧光相位测量荧光寿命具有带宽小和抗干扰能力强的优点，是荧光氧传感器信号检测技术发展的主流方向[9-10]。锁相放大技术常用于交变信号相位检测，基于AD630 调制解调芯片的模拟锁相放大技术用于荧光相位检测具有器件少和分辨率高等优点[11]，但也存在电路同频困难和噪声大的问题，采用现场可编程逻辑门阵列数字正交锁相放大技术能够有效克服模拟锁相同频困难的缺点，大幅提高检测精度，但电路更复杂，器件成本也较高[12]。

异或门（XOR）鉴相是一种电路简单的相位测量方法。本研究在异或门模拟鉴相电路用于荧光相位检测[13]的基础上，将其改进为数字鉴相电路，即脉宽测量采用微控制器的输入捕获功能，避免模拟鉴相电路中低通滤波和模数转换引入误差。以PtTFPP 为荧光指示剂，选用氧气渗透系数差异较大的3 种聚合物PVC、PS 和EC 作为基质，采用刮刀涂膜工艺制备荧光氧敏感膜。利用自建的荧光相位测量装置，测量氧敏感膜在不同氧分压气氛下的荧光寿命，并考察了相对湿度对不同基质材料对荧光寿命的影响。通过循环切换腔体的氧分压，观察荧光相位的动态变化，研究了基质材料对氧敏感膜响应性能的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

D0719B 气体质量流量控制器（北京七星华创公司）；F-7000 荧光分光光度计（日本日立公司）；VAC-V2 压差法气体渗透仪（济南兰光机电技术有限公司）；T330 光学接触角仪（瑞典Biolin 科技公司）；荧光相位测量系统和动态配气装置（自建）。

PS、PVC、EC、四氢呋喃、无水乙醇、甲苯和三氯甲烷均购于国药集团化学试剂有限公司；PtTFPP 购于美国Frontier Scientific 公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 高分子基质膜的制备

将PS、PVC 和EC 分别与三氯甲烷、四氢呋喃和甲苯-乙醇（4∶1，m/m）混合液混合并充分搅拌直至溶解，得到质量分数为20%的3 种聚合物溶液[14]。采用刮刀涂膜工艺将聚合物溶液在玻璃板上制膜，刮刀高度设置为300 μm。待所涂覆薄膜中的有机溶剂完全挥发，得到厚度约为30 μm 的PVC、PS 和EC 薄膜。

1.3 氧敏感膜的制备

参考文献[15]的方法，采用刮刀涂膜工艺制备氧敏感膜。将荧光指示剂PtTFPP 在充分搅拌下溶解于四氢呋喃中，制备质量分数为0.2%的PtTFPP 溶液（溶液1）。将PS、PVC 和EC 分别与三氯甲烷、四氢呋喃、甲苯-乙醇（4∶1，m/m）混合液混合并充分搅拌直至溶解，得到质量分数为20%的3 种聚合物溶液（溶液2）。随后按质量比1∶2 将溶液1 与溶液2 混合并充分搅拌均匀，得到含有荧光指示剂的聚合物复合溶液。将聚合物复合溶液分别在聚苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜带上制膜，设定刮刀高度100 μm，待所涂覆薄膜中的有机溶剂完全挥发，得到负载于PET 膜带上的厚度为10～20 μm 的氧敏感膜。

1.4 高分子基质膜水接触角和氧渗透性能测量

水接触角采用T330 光学接触角仪测量，采用座滴法[16]，液滴体积为4 μL，接触角取为同一样品上不同位置至少5 次测量的平均值。采用国标（GB/T1038-2000）压差法[17]测量高分子基质膜氧渗透系数。

1.5 氧敏感膜荧光性能测量

采用异或门数字鉴相电路测量荧光相位，原理如图1 所示，以STM32F103 系列微控制器为核心处理器，以中心波长为400 nm 的紫光LED 为激发光光源（LED1），微控制器（MCU）产生4 kHz 方波脉宽调制信号（MOD1），经多级积分和放大转换形成同频率正弦信号（MOD2）给LED 供电。激发光经短波通滤光片（OF1）照射氧敏感膜，发射荧光光波为与激发光同频率的正弦光波信号；经长波通滤光片（OF3），采用PIN 光电二极管（PD）光电转换、交流放大（AMP）和带通滤波（BP）、过零检测电路（COMP），由正弦信号转换成同频率方波信号。荧光方波信号与激发光方波信号同时输入异或门逻辑运算芯片，输出信号转变为8 kHz 频率脉冲信号，其脉冲宽度（占空比）大小代表荧光与激发光相位差，脉宽测量采用微控制器的输入捕获功能。由于电路中使用了多个电容，并且各级电路存在寄生电容和电感，会造成电路延时，因而在电路中同时设置中心波长630 nm 的红光LED2 作为参考光源，用于消除光电转换和信号调理电路中由于温度或其它因素导致的相位差测量偏差。荧光寿命可由式（5）计算[18-19]：

图1 荧光相位测量原理图Fig.1 Schematic of fluorescence phase measurement

高压气瓶的氮气和氧气分两路，采用质量流量控制器调节两种气体比例来控制测试气体氧分压大小。湿度调节实验采用鼓泡加湿法，测试气体一路通过盛水广口瓶鼓泡增加湿度，另一路不加湿，调整两路阀门控制湿度大小，混合后气体经过湿度测量后再通入测试腔测试。为了提高可调节的最大湿度，可以选择在广口瓶中盛放热水进行鼓泡加湿，经实验测量，采用该方法相对湿度最大可控制在94%，故相对湿度调节范围为0～94%。

2 结果与讨论

2.1 聚合物基质的氧渗透性能和亲疏水性

通过氧气渗透实验对3 种聚合物膜PVC、PS 和EC 进行测试。三者的氧气渗透系数分别为9.04×10–15、3.22×10–13和9.62×10–13cm3·cm/（cm2·s·Pa），其中PVC 的氧气渗透系数最小，这是由于其存在一定的结晶态[14]，阻碍了氧气的扩散。

水接触角可以反映材料的亲疏水性。如图2 所示，EC 膜的水接触角最小（70°），而PS 和PVC 膜的接触角较大，分别为85°和89°，表明EC 具有较强的亲水性。这可能是因为其分子结构中含有C—O 亲水基团，而PS 和PVC 的分子结构中不含C—O 或H—O 亲水基团，因此二者的亲水性较弱。

图2 聚合物膜水接触角测量：（A）乙基纤维素（EC）；（B）聚苯乙烯（PS）；（C）聚氯乙烯（PVC）Fig.2 Water contact angles of polymer films: (A) Ethyl cellulose (EC);(B) Polystyrene (PS);(C) Polyvinyl chloride (PVC)

2.2 荧光发射和氧猝灭

图3A 和3B 为PVC、PS 和EC 聚合物基质的荧光氧敏感膜分别在395 nm 紫外灯和日光灯照射下的照片。不同聚合物基质的荧光氧敏感膜都呈现均匀的红光发射，其中以PVC 为基质的敏感膜具有最高的发光强度，其次是PS，EC 的发光强度最弱。图3C 为3 种敏感膜的荧光光谱，发射峰值在650 nm 附近，与PtTFPP 荧光发射峰一致，表明聚合物膜中的荧光发射来自于PtTFPP[20]。荧光强度的顺序为PVC＞PS＞EC，与聚合物的氧渗透系数大小顺序相反。氧气渗透系数越小，空气中的氧气分子越难渗入膜内部，氧分子对激发态的荧光指示剂分子的猝灭作用较弱，因此荧光发射强度较大。

图3 聚合物基质氧敏感膜在空气中紫外灯（λem=395 nm）下（A）和日光灯下（B）的照片；（C）聚合物基质氧敏感膜的荧光发射光谱（λex=390 nm）Fig.3 Photos of oxygen-sensitive films with PVC,PS and EC as matrices under UV lamp (λem=395 nm)irradiation(A)and under white light(B)in air;(C)Fluorescence emission spectra of oxygen sensing films excited at 390 nm.

图4 展示了不同基质氧敏感膜的荧光相对寿命随氧分压变化的曲线。对于以PVC 为基质的敏感膜，由于其氧渗透系数较低，无论荧光分子处于表层还是内部，与氧分子发生碰撞的概率都较低，导致猝灭作用较弱，因此其Stern-Volmer 曲线符合单位点模型。而对于以PS 和EC 为基质的敏感膜，其荧光相对寿命随氧分压的变化在高氧和低氧段偏离线性关系，这是因为敏感膜的表层和内部的氧浓度不同。荧光猝灭作用可分为猝灭效应较强和猝灭较弱部分，因此采用修正的双位点模型进行拟合（式（6））[5]：

图4 聚合物基质氧敏感膜的Stern-Volmer 曲线Fig.4 Stern-Volmer plots for oxygen-sensitive films with different polymer matrices

式中，f1和f2为两部分所占百分比，二者之和等于1；Ksv1和Ksv2分别为猝灭效应较强和较弱部分的猝灭常数。

KSV常数大小直接反映荧光氧猝灭效应的强弱，即敏感膜对氧浓度变化的灵敏程度。由表1 可知，3 种聚合物基质的KSV常数大小顺序为EC ＞PS ＞PVC，这与氧气分子在这些聚合物中的渗透系数大小顺序一致。EC 具有最大的氧气渗透系数和KSV常数，这是因为氧气在EC 基质膜中的扩散速度较快，导致荧光分子与氧分子的碰撞概率增加，从而强化了荧光猝灭效应。随着氧分压增加，荧光发射强度和寿命迅速下降。例如，在无氧的氮气气氛下，荧光寿命为79.5 μs，而当氧分压增加到10 kPa 时，荧光寿命减至12.3 μs。如果光源调制频率保持不变，高氧分压时测量误差会增大。因此，以EC 为基质的氧敏感膜只适用于低浓度氧含量或痕量氧检测。PS 的氧渗透系数和KSV常数次之，氧猝灭效应居中，在中高氧浓度下仍有较强的荧光发射，故适合于中高氧浓度的测量。PVC 的氧渗透系数和KSV常数最小，氧猝灭效应也最小，当氧分压达20 kPa 时，荧光信号仍然较强，寿命仍达25.9 μs，因此适用于高氧浓度的测量。

表1 聚合物基质氧敏感膜基于双位点Stern-Volmer方程的拟合结果Table 1 Fitting results of the two-site Stern-Volmer equation for oxygen sensing films with different polymer matrices

图5 展示了3 种聚合物基质氧敏感膜的荧光寿命随相对湿度变化的曲线。对于以PS 和PVC 为基质的敏感膜，无论在无氧还是有氧的气氛下，荧光寿命几乎不受相对湿度影响。然而，以EC 为基质的氧敏感膜在无氧气氛下不受相对湿度影响，但在有氧气氛下，荧光寿命随相对湿度增加而增大。这是因为EC分子结构中含有C—O 亲水基团，导致水分子易于在膜表面凝聚，阻碍了气相中的氧分子进入膜内，减小了荧光猝灭效应，因此其荧光寿命随湿度增大而增加。相反地，PS 和PVC 分子结构中不含亲水基团，水分子不易在膜表面凝聚，因此二者的荧光寿命不受湿度变化的影响。

图5 聚合物基质氧敏感膜（A）EC、（B）PS 和（C）PVC 的荧光寿命随湿度变化曲线Fig.5 Fluorescence lifetime as a function of humidity for oxygen-sensitive films with polymer matrix of(A)EC,(B) PS and (C) PVC

2.3 氧敏感膜的动态响应特性

动态响应特性是氧敏感膜的重要指标，通常用响应时间衡量[21]。响应时间是指敏感膜荧光信号达到或接近稳定值所需的时间，通过循环切换气氛进行测量。以EC 为基质的氧敏感膜具有强烈的氧猝灭效应，因此在低氧分压区间（0～2 kPa）进行气氛循环切换，而PS 和PVC 氧敏感膜在较高氧分压下仍然显示出较强的荧光信号，所以在氮气-空气气氛之间进行循环切换。设置采样周期为0.5 s，将气体切换开始至相位信号变化到稳定值的90%所需时间定义为响应时间。图6 为3 种氧敏感膜的动态响应曲线，并将响应时间和恢复时间列于表2。EC 的响应时间较快，在从氮气气氛切换到2 kPa 氧分压的相位测量过程中，t（90）↓为5.0 s；从2 kPa 氧分压切换回氮气气氛的相位测量过程中，t（90）↑为8.5 s。PS 的动态响应比PVC 快，PS 的响应时间t（90）↓和恢复时间t（90）↑分别为5.5 s 和10.0 s，而PVC 分别为30.5 s和32.0 s。这些响应时间的长短顺序与聚合物基质的氧气渗透速率的大小顺序一致。此外，从低氧到高氧的响应时间比从高氧到低氧的恢复时间短，说明氧气从气相进入聚合物内部的过程比反向过程快。

表2 氧敏感膜在不同氧分压切换测试条件下的响应特性。Table 2 Response characteristics of oxygen-sensitive films when switching alternately between different oxygen partial pressures

图6 聚合物基质氧敏感膜的相位动态响应曲线：（A）EC 在氮气和2 kPa 氧分压之间切换；（B）PS 和PVC 在氮气和空气之间切换Fig.6 (A) Phase changes of EC-based oxygen-sensitive films with alternate exposure to nitrogen and to 2 kPa oxygen;(B)Phase changes of PS-based and PVC-based oxygen-sensitive films with alternate exposure to air and to nitrogen

3 结论

本研究构建了异或门数字鉴相电路用于荧光相位测量，以EC、PS 和PVC 聚合物为PtTFPP 荧光指示剂的基质，探究了聚合物材料的氧渗透速率、亲疏水性与荧光氧猝灭性能之间的关系。实验结果表明，PVC 具有较低的氧渗透系数，其荧光寿命与气相氧分压符合单位点Stern-Volmer 方程，显示膜表层和内部的荧光分子与氧分子的猝灭作用较弱且无显著差异。相比之下，EC 和PS 具有较高的氧渗透系数，其荧光寿命与氧分压的关系符合双位点Stern-Volmer 方程，表明在聚合物膜表层和内部，荧光指示剂与氧分子的猝灭作用存在差异。EC 的KSV最大，PS 次之，PVC 最小，与聚合物的氧渗透系数大小顺序一致。此外，EC 具有较强的亲水性，导致其荧光寿命在含氧气氛中随湿度增加而延长，而对于偏疏水的PS和PVC，荧光寿命保持不变。根据荧光氧猝灭效应的强弱，EC、PS 和PVC 基质分别适用于低、中高和高氧浓度的测量。本研究结果有助于理解聚合物基质对荧光氧猝灭的影响，为荧光猝灭型氧传感器的设计提供了参考。