利用SNP 标记划分玉米地方种质杂种优势类群

张培风 任帅 孙佩 王蕊 张瑞平 王文洁 马朝阳 李合顺 王学军 周联东

（河南省新乡市农业科学院，新乡 453000）

杂种优势是选育玉米新品种的重要理论基础[1]。了解掌握玉米地方种质群体遗传结构、遗传多样性和类群间遗传关系，划分杂优类群，能够使育种者思路更加清晰，降低杂交组合组配的盲目性，育种目标更易实现[2]。分子标记是主要以个体之间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，SNP作为继RFLP 和SSR 之后最有前途的第三代分子标记，具有分布密度高、遗传稳定性好、易于实现自动化分析等优势，因此目前被广泛应用于遗传图谱构建、全基因组关联分析和分子标记辅助育种研究中，研究者也开始利用SNP 等分子标记开展玉米种质资源的遗传多样性和类群划分的研究。吴金凤等[3]利用1041 个SNP 位点对51 份玉米地方种质进行遗传多样性分析，最终将其划分为7 个杂种优势群。高嵩等[1]利用6973 个高质量SNP 标记对205 份材料进行群体遗传结构、遗传多样性和类群间遗传关系分析，最终划分为7 个杂种优势群，与系谱来源具有较好的一致性。史亚兴等[4]利用SNPs 对39 份不同基因型的糯玉米地方种质进行基因型分析，划分为五大类群，明确了亲缘关系，为糯玉米种质资源利用及品种选育提供参考依据。曾艳华等[5]利用56K SNP 芯片对广西45 个爆裂玉米农家品种进行基因组扫描，分为三大类群，其中，来源相同的农家品种大多聚在一起，表明广西农家品种遗传相似性较高。肖颖妮等[6]利用5067 个高质量的SNP 对全国范围内385 个鲜食玉米进行群体结构划分和遗传距离的估算，最终划分为三大类群，结果与聚类分析结果大部分一致，较全面地解析了我国当前鲜食玉米的遗传多样性，可为鲜食玉米育种提供理论指导。Van Inghelandt等[7]研究表明，利用SNP 标记的方法计算的自交系遗传距离和基因多样性更加精确。

玉米地方种质对地方环境适应性强、遗传基础丰富，已成为不可或缺的育种材料，而且受基因型和环境互作影响，育种家选择理想的基因型和杂交组合较难实现[8]。同时，随着大量优质玉米品种被不断开发及应用，有必要对现有的地方材料进行系统分析，为未来育种提供理论依据[9]。本研究选用100 份河南省玉米地方种质，基于SNP 芯片技术对其遗传多样性进行分析和杂优类群划分，为玉米地方种质资源杂优模式开发与利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试材料中100 份材料为河南省内广泛搜集、整理的玉米地方种质，编号及名称详见表1。20 份参照品系分别为：SHEN5003、YE52106、81162、HUOBAI、HUANGZAOSI、YE478、Z58、C7-2、Woyu4B、B73、DK517A、XY335B、LH185、517B、PHTD5、SHEN137、Q319、P138、DMY2B、228B。

表1 100 份河南省玉米地方种质编号及名称

1.2 DNA 提取苗期对每个品种5 株植株的幼嫩叶片进行混合取样，采用磁珠法提取306 个样本，打孔至96 孔板，分别装置5mm 钢珠，盖上硅胶盖，常温保存备用。提取的DNA 分别通过琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测DNA 的纯度、浓度等质量状况。琼脂糖电泳检测DNA 条带单一、明亮、完整无降解、无拖尾现象，将DNA 样品风干，加100μL 1×TE 缓冲液，37℃保温箱温育2h，于-20℃保存备用。

1.3 SNP 芯片分型及统计分析基于金苑（北京）农业技术有限公司Affymetrix 测试平台，采用高密度玉米微阵列芯片技术对SNP 标记进行检测。对100 个玉米地方种质进行全基因组扫描，对样本的原始SNP 分型，再对SNP 标记进行过滤，首先要删除在群体中没有多态性的标记，其次删除最小等位基因频率较小的、缺失率较大的标记，获得质量较高的SNP 标记，用来进行下一步的分析。

1.4 数据分析利用Tassel 软件对2 个品种之间的遗传距离进行分析，对类群进行主成分分析，明确各类群材料的分群特征，根据品种之间的遗传距离，利用MEGA7.0 软件以邻结法（NJ，Neighbor-joining）计算品种间的Nei's 遗传距离，构建聚类图。采用组间平均联接法对玉米地方种质资源的综合性状进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SNP 位点总体评价利用1021 个SNP 标记对120 份种质资源的基因型进行检测，通过PowerMarker V3.25 分析其基因分型数据，杂合率在0～29.3%之间，平均值为2.5%；缺失率在0～19.4%之间，平均值为1.7%；多态性信息含量（PIC）的变化范围为0～0.395，平均值为0.295。PIC 值是衡量DNA 座位变异程度高低的重要指标，当PIC 值＞0.50 时，表明其为高度多态性；当0.25＜PIC 值＜0.50 时，表明其为中度多态性；当PIC 值＜0.25 时，表明其为低度多态性。本研究中，1021 个SNP 位点在120 份玉米地方种质中的平均PIC 值为0.295，说明玉米地方种质为中度多态性，遗传多样性较好。

2.2 聚类分析通过PowerMarkerV3.25 软件应用Nei's 算法计算120 份玉米种质两两之间的遗传距离，自交系遗传距离变化范围为在0.010～0.703，平均值为0.234，其中，遗传距离最小的2 个自交系是短腿玉米和黄马牙，遗传距离最大的2 个自交系是鹅林白和PHTD5。

对120 份玉米地方种质进行遗传距离聚类，构建NJ 聚类图，进行聚类分析（图1）。类群划分结果表明，以20 个我国常用玉米骨干自交系作为杂种优势群划分的参照，所有材料可被分为7 个杂种优势类群。第1 类群为国内瑞德群，包括SHEN5003、YE478、Z58、81162；第2 类群为黄源群，包括DF-81～YE52106 共105 份，其中大部分自交系为地方种质资源；第3 类群为BSSS 群，包括DK517A、B73；第4 类群为NSSS 群，包括XY335B、LH185；第5类群为Iodent 群，包括PHTD5、517B；第6 类群为78599 群，包括P138、SHEN137、Q319；第7 类群为欧硬群，包括DMY2B、228B。地方种质资源聚类结果与其地理来源无确定性关系，不同来源地的品种互相穿插聚在一起，单亲缘关系较近的资源基本上聚到同一亚群中，如遗传背景相似Woyu4B 和C7-2，B73 和DK517A，XY335B、LH185、517B 和PHTD5，SHEN137、Q319 和P138 分别聚在一起。

图1 基于SNP 标记的供试自交系的聚类图

2.3 群体间遗传距离根据类群划分结果，计算出7 个杂种优势群的群体间遗传距离（表2）。7 个杂种优势群之间的遗传距离变化范围在0.453～0.653 之间，其中，Iodent 群和NSSS 群之间的遗传距离最近，欧硬群和78599 群之间的遗传距离最远。

表2 杂种优势群群体的遗传距离

在遗传距离为0.25 时，根据同一类群的玉米品种间距离接近且综合性状值差异较小的原则，将100 份玉米地方种质划分为三大类群[10]（图2）。第Ⅰ类群包括51 份种质，对应的编号分别为DF-118、DF-227、DF-60、DF-164、DF-4、DF-59、DF-11、DF-129、DF-428、DF-176、DF-45、DF-419、DF-88、DF-171、DF-84、DF-170、DF-98、DF-142、DF-44、DF-179、DF-130、DF-302、DF-108、DF-267、DF-280、DF-422、DF-5、DF-6、DF-150、DF-125、DF-354、DF-3、DF-431、DF-126、DF-66、DF-131、DF-392、DF-224、DF-362、DF-226、DF-236、DF-375、DF-387、DF-215、DF-216、DF-232、DF-52、DF-29、DF-30、DF-406、DF-368，这类种质主要特征为早熟，株高、穗位高较高，穗粗较粗，千粒重较重；第Ⅱ类群包括46 份种质，分别为DF-23、DF-107、DF-26、DF-426、DF-366、DF-51、DF-282、DF-83、DF-101、DF-36、DF-228、DF-292、DF-425、DF-251、DF-254、DF-195、DF-69、DF-220、DF-221、DF-2、DF-200、DF-225、DF-62、DF-70、DF-190、DF-286、DF-34、DF-141、DF-186、DF-93、DF-273、DF-395、DF-122、DF-152、DF-33、DF-158、DF-65、DF-104、DF-382、DF-380、DF-8、DF-376、DF-258、DF-261、DF-81、DF-35，这类种质主要特征为晚熟，株高、穗位高较低，穗粗较细，千粒重较轻；第Ⅲ类群包括3 份种质，分别为DF-77、DF-137、DF-46。

图2 基于遗传距离构建的聚类图

3 结论与讨论

分子标记的发展使得在分子水平上研究玉米遗传多样性得以实现。目前国内外诸多学者利用SSR标记研究不同来源的甜玉米种质的遗传多样性，并划分了类群。近年来，SNP 标记逐渐取代了传统标记，并且在普通玉米种质遗传组成分析上被广泛应用[11]。玉米杂种优势群及其模式也已成为指导玉米育种实践的重要依据，利用SNP 标记分析玉米地方种质之间的遗传距离及遗传构成，是聚类分析和杂种优势划分类群的基础[12]。SNP 标记也因具有遗传稳定性好、位点丰富且分布广泛、代表性强、易于实现自动化分析检测等优点，在高密度遗传图谱构建、基因精确定位、群体遗传结构分析及系统发育等方面广泛应用[13-17]。Lu等[18]利用SNP 标记对770 份国内外玉米地方种质进行遗传多样性分析，结果表明，1034 个SNP 位点的多态性信息含量在0.003～0.375 之间，平均值为0.259。师亚琴等[19]利用4550 个SNP 位点对80 份玉米地方种质进行遗传分析，将79 份玉米地方种质划分为两大类、7 个亚群，结果与系谱来源有较好的一致性。本研究利用1021 个SNP 标记对120 份地方种质资源的基因型进行分析，结果表明，1021 个SNP 标记在供试材料中的多态性信息含量的平均值为0.295，杂合率平均值为2.5%，缺失率平均值为1.7%。将供试的20 份参照物和100 份地方种质划分为7 个杂种优势群，划群结果和系谱来源具有较好的一致性，利用SNP 标记对种质资源进行杂种优势群划分可获得比较理想的结果，特别是对于系谱不清晰的新系，可很好地通过类群划分对杂交种进行组配，这样能够尽可能地避免大量且盲目的测配工作，从而提高育种组配效率。

本研究中类群划分结果表明，以20 个我国常用玉米骨干自交系作为杂种优势群划分的参照，120份材料可被分为7 个杂种优势类群，划分结果与系谱来源有较好一致性，如100 份地方种质全部被聚为黄源类群，表明来自河南地方种质资源遗传背景相同，亲缘关系较近，纯合度较高。其中，大柿黄和黄皮糙的矩阵输出图遗传距离为0.023；黄皮糙和高杆青的矩阵输出图遗传距离为0.051；白琉璃头和小白糙的矩阵输出图遗传距离为0.147，遗传距离较近，可以看出地方种质资源间遗传相似度较高，有相似血缘关系。说明利用SNP 标记对玉米地方种质资源进行杂种优势群划分能够获得比较理想的结果。由群体间遗传距离结果显示，Iodent 群和NSSS群之间的遗传距离最近，这与其系谱关系也是相吻合的；欧硬群和78599 群之间的遗传距离最远，这也与78599 该杂交种血缘与国内的七大类群关系较远相吻合。其中遗传距离最小的2 个地方种质资源是短腿玉米和黄马牙，纯合度较高，遗传关系最近，遗传距离为0.010。本研究结果可作为杂优模式的选择依据。