小麦花药漂浮培养技术

刘宁涛 赵远玲 车京玉 张起昌 田超 尹雪巍 代丽婷 邵立刚

（1 黑龙江省农业科学院克山分院，齐齐哈尔161005，2 黑龙江省农业科学院作物资源研究所，哈尔滨 150081）

小麦花药培养是一项快速、有效稳定育种材料的技术，具有稳定杂种性状、缩短育种年限、选择效率高等优点[1-2]，也是产生单倍体材料的主要方法之一。围绕小麦花药培养过程中供体材料的基因型、培养基、愈伤组织诱导、绿苗分化及染色体加倍技术中效率低的问题，科学家们开展了大量的研究使得小麦花药培养效率得到一定的提高，同时也相继育成了京花1 号、Florida、花培5 号、花培28 号、豫麦37、宁春50 等小麦品种应用于生产[3-5]。然而供体材料的基因型仍然是影响花药培养的主要因素[6-8]，在配制杂交组合的过程中需选择培养能力强的材料作为亲本，以减少花培对基因型的依赖，提高培养效率，除此之外培养基、激素配比、培养条件、碳源等也是影响花药培养的关键因素。最新研究成果表明麦芽糖作为碳源能够形成胚状体并进一步再生植株，且能够有效减少白化苗的再生[9]。在花药培养方式方面的研究也表明浸润式培养、液体培养方式[10]能够得到更多的愈伤组织和绿苗，说明利用液体培养能够有效地提高小麦花药培养效率。周迪等[11]引进匈牙利小麦液体诱导培养基W14-F，对人工合成小麦和普通小麦F1花药培养愈伤组织诱导研究，发现该培养基在愈伤组织诱导率方面明显高于国内普遍应用的C17、N6 和1/2 MS 培养基。

本实验室采用匈牙利小麦育种家Pauk Janos 花药漂浮培养技术[12]，并在其基础上简化了生根培养、优化了预处理等环节，愈伤组织产出明显提高，同时2021 年加倍率达到了64.6%，大幅度提高了小麦花药培养的效率。为了更好地促进我国小麦花药培养育种技术，对实验室运用的小麦花药漂浮培养技术进行梳理，期望能够为国内利用小麦花药培养技术开展单倍体选择的育种者们提供参考。

1 花药培养基配制

小麦花药愈伤组织诱导培养基为W14-F，再生培养基为190-2Cu，具体配方见表1。

表1 小麦花药诱导、分化、生根培养基配方

W14-F 诱导漂浮培养基配制完成后分装于培养皿中，每皿分装液体培养基12mL，用封口膜封口后灭菌，备用。190-2Cu 分化培养基为固体培养基，分装于直径为9cm 的培养皿中，每个培养皿中10mL 培养基，灭菌备用。培养基pH 值为5.8。

2 花药培养步骤[14]

2.1 外植体选择与预处理外植体选择 选择F2重点组合作为外植体进行花药培养。外植体取材与预处理 取大田种植的健壮植株，用显微镜进行镜检，选择小孢子发育正处于单核靠边期的幼穗最佳；形态学上一般表现为幼穗顶部处于旗叶与旗叶叶耳1/3～2/3 处的植株，用剪刀沿着茎部斜口剪断，每个组合取20～30 穗，并用橡皮筋捆成一捆，写好标签，后放入装有自来水的小桶中，尽快带回实验室。用塑料密封袋密封后置于4℃冰箱内低温处理3d。外植体灭菌 接种之前将幼穗剥出后放入血清瓶中，加入一定量的消毒液（次氯酸钠和无菌水比例为1∶1），并加入2 滴土温80，水平方向放至摇床上震荡20min。血清瓶用75%的乙醇擦拭消毒后放入超净工作台中，倒出消毒液，后用无菌水冲洗幼穗3～4 次，直到瓶内不再产生泡沫为止。

2.2 诱导方法接花药手部用75%乙醇消毒晾干后取已高压灭菌的小镊子一把，蘸取75%的乙醇再用酒精灯外焰烤火灭菌，之后放旁边冷却备用。接花药时用左手夹住已灭菌的幼穗，用小镊子去掉颖壳剥出花药，放置于培养基上。愈伤组织诱导培养将取出的小麦花药放入装有诱导培养基的培养皿中（直径9cm），每个培养皿中约300 个花药，接种完成后需用封口膜及时密封。把密封好的培养皿放入恒温培养箱中，在32℃下暗培养3d，再转入28℃培养箱中暗培养50～60d。愈伤组织分化培养 当愈伤组织形成后，直径1～2mm 时，及时在无菌环境下将愈伤组织转移到分化培养基，培养箱条件为25±1℃、16h 光照培养，光强2000～3000Lx，8h 暗培养，30d 左右会出现绿苗。

2.3 花药培养加倍技术绿苗出现2～3 片绿叶时，转入盆栽，待新根生长健壮后移到温室内炼苗3～4d，后移栽到花盆中。

2.3.1 化学药剂加倍法分蘖期将单倍体绿苗根部用自来水冲洗干净，剪去根尖留约2cm 左右，根部浸入含有0.2%秋水仙碱+2%DMSO（二甲基亚砜）的溶液中5h，随后用自来水冲洗过夜、移栽，保持高湿环境下16h 光照，白天温度18℃，晚上15℃，约2周出现新分蘖后正常管理。

2.3.2 自然加倍法绿苗出现分蘖时给予适当的低温胁迫约6 周，弱光条件下能够实现部分植株自然加倍。

3 花药培养技术注意事项

（1）在选择花药培养组合时，其亲本之一应具有强培养力且一般配合力高，以减少花培材料对基因型的依赖，进而提高花药培养的效率。（2）多数情况下研究者们选择F1组合材料进行花药培养。匈牙利小麦花药培养过程中在F1对主要流行性病害等不利性状进行一次淘汰，选择F2植株进行花药培养，这样获得的植株更加接近育种目标，这一点值得我们借鉴。（3）花药培养过程中的污染问题。在进行花药培养之前需要对培养室环境进行彻底消毒，同时要重视对外植体材料和器皿的消毒，也可以在诱导培养基中适当加入一些抗生素，降低花药培养过程中污染率。另外，匈牙利的漂浮诱导培养基中加入了Ficoll（一种聚蔗糖），对于污染有一定的抑制作用，其作用有待于进一步研究。（4）外植体预处理时要注意密封性，并保持一定的湿度，防止外植体材料水分散失；恒温培养箱培养期间也需保持一定湿度；绿苗移栽中也一定要保持湿度，提高幼苗的成活率。（5）经诱导形成的愈伤组织直径达到1～2mm 时及时转入分化培养基中进行再培养，直径超过2mm，其再生能力会有所下降。（6）花药培养过程中尽量多接种花药，构建大量的基础群体，以便于能够获得较多的理想植株。