骨痨愈康丸通过JAK3/STAT3信号通路对佐剂性关节炎大鼠炎症反应的影响

李金益 宋敏,2* 田杰祥,2 王凯 范凯

1.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州 730000 2.甘肃中医药大学附属医院骨科，甘肃 兰州 730000

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是好发于手、足等小关节以关节滑膜炎性改变、血管翳生成、软骨与骨破坏为主要病理表现的自身免疫性疾病，其病因及发病机制尚未完全揭示[1]。RA病情缠绵难愈，治疗周期长，发病率高，如不能及时治疗，会引起关节畸形、功能丧失，最终导致残疾。RA的治疗尚无特效药物能有效治愈，因此寻求高效、安全、经济的治疗手段是风湿病学界研究的重要方向。中医药在RA的防治中疗效确切、安全性高，具有良好的应用前景。骨痨愈康丸是甘肃中医药大学附属医院研制的院内制剂，以补肾通络法为治则研制，具有补肾活血、通络止痛的功效，已在临床使用数十年，在缓解RA症状、改善患者的生活质量方面疗效确切。前期研究[2-3]表明，骨痨愈康丸能够降低相关细胞因子水平来抑制全身炎症反应，保护关节，增加骨密度，有效改善患者病情，但具体作用机制尚未阐释清楚。因此，本研究通过建立CIA大鼠模型，观察骨痨愈康丸对模型大鼠关节肿胀度和踝关节软骨及滑膜组织中JAK3/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响，从JAK3/STAT3信号通路角度探讨骨痨愈康丸对RA的干预机制，以期为骨痨愈康丸防治RA的进一步研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物及药物：选取SPF级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量(220±20)g，动物生产许可证号SCXK(甘)2020-0001，由甘肃中医药大学实验动物中心提供。饲养于温度(22±2)℃、相对湿度(50±10)%环境，每日光照时间12 h，自由进食饮水，适应性饲养7 d。本实验通过了甘肃中医药大学伦理委员会审批，文件批号：2021-002。骨痨愈康丸(甘肃中医药大学附属医院，60 g/480丸，甘药制备字：Z20190001000)。

1.1.2试剂及仪器设备：酪氨酸激酶抑制剂AG490(MCE 批号：65923)；牛Ⅱ型胶原蛋白(Bovine Type Ⅱ Collagen 批号：190078)；完全弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant Complete，Sigma，批号：LB29884)；ELISA试剂盒；HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120)；BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司，批号：PC0020)；SP-9001兔SP试剂盒、DAB显色试剂盒(厂家：中杉金桥)；TRIeasyTMTotal RNA Extraction Reagent(YESEN，货号：10606ES60，批号：HB170809)；HifairⅢ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(YESEN，货号：11123ES60，批号：H11255080)；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox)(YESEN，货号：11203ES08，批号：H4104640)。高速冷冻离心机(德国Eppendorf，型号：5424R)；酶标仪(美国Bio Rad公司，型号：iMark)；恒温培养箱(上海精宏设备公司，型号：DNP-9022)；包埋机(上海精宏设备公司，型号：101-1AB)；切片机(德国，型号：LEICA2016)；台式电热恒温鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司，型号：101-1AB)；显微镜(Leica DM2500)；NanoDrop核酸浓度测量仪(美国Thermo，型号：ND-ONE-W)；实时定量PCR仪(美国Thermo，型号：StepOne Plus)。

1.2 方法

1.2.1实验分组:将60只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组(10只)和造模制备组(50只)。除正常对照组外，将其他各组大鼠制备成CIA模型[4]。将牛Ⅱ型胶原蛋白和完全弗氏佐剂按1∶1比例在冰浴环境下充分混合，使用匀浆器充分摇匀，产生最终浓度为1 mg/mL的混合乳剂。对每只大鼠背部脊柱两侧、尾根部多点行皮下注射，每只大鼠注射混合乳剂0.3 mL，促使背部和尾根部发生致敏反应。初次免疫1～2周后，再对每只大鼠尾根部及双后足足垫分别注射0.1 mL混合乳剂加强免疫，2周后模型制备完成。采用关节炎指数(AI)评分评估模型大鼠炎性反应情况[5]，观察大鼠双后足，按0～4级进行评分，AI≥2提示造模成功。将模型制备成功大鼠随机分为4组：CIA组、GL组、GL+AG490组、AG490组。

1.2.2干预方法：参考《中药药理研究方法学》[6]，根据人和大鼠计量折算系数确定给药量。AG490组与GL+AG490组给予足背静脉注射配制好的酪氨酸激酶抑制剂AG490(剂量为1 mL/只)，GL组和GL+AG490组给予骨痨愈康丸506 mg/(kg·d)灌胃。Control、CIA、AG490组给予同体积0.9 %生理盐水灌胃。灌胃4周后取材。

1.2.3指标检测

1.2.3.1关节组织病理学观察：取大鼠左侧踝关节，用乙醇棉球消毒关节区域，逐层分离皮肤、肌肉组织，暴露踝关节，解剖关节软骨和滑膜，用4 %多聚甲醛固定。运用苏木精-伊红染色法将滑膜组织进行常规石蜡包埋、切片、染色，光镜下观察软骨和滑膜病理变化。

1.2.3.2血清生化指标检测：于末次灌胃后，各组大鼠禁食不禁水24 h，通过腹腔注射1 %戊巴比妥钠麻醉大鼠，行“三线定位法”心脏采血[7]。取血后，在4 ℃下以3 000 r/min离心20 min，按照ELISA试剂盒规范检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量水平。

1.2.3.3免疫组化法检测JAK3、STAT3的蛋白表达：取大鼠踝关节，消毒，取出所需软骨和滑膜组织，固定，石蜡包埋切片，贴片。免疫组化染色，石蜡切片脱蜡和水化，自来水冲洗2次，PBS洗5 min ×3次；修复，3%的过氧化氢孵育15 min；加一抗，37 ℃复苏35 min，PBS洗5 min ×3次；加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min ×3次；加三抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗5 min ×3次；DAB显色8 min，镜下观察，苏木素复染，室温，60 s，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

1.2.3.4RT-PCR法检测JAK3、STAT3mRNA的表达：取大鼠右侧踝关节，消毒，逐层分离皮肤、肌肉、剥离出软骨和滑膜组织，-80 ℃保存。分别研磨软骨和滑膜组织提取总RNA，运用RT-PCR法检测，其引物序列如表1。结果采用2-△△CT法分析数据。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 骨痨愈康丸对模型大鼠足趾厚度的影响

造模完成后，大鼠双后足足趾及踝关节出现红肿等炎症反应。与Control组相比，CIA、GL、GL+AG490、AG490组大鼠右足足趾厚度显著增厚(P<0.05)；经过4周灌胃治疗之后，GL、GL+AG490、AG490组大鼠右足足趾厚度逐渐降低(P<0.05)；其中，GL+AG490组改善最为明显。见表2。

表2 各组大鼠右足足趾厚度的比较

2.2 骨痨愈康丸对模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量的影响

与Control组相比，CIA、GL、GL+AG490、AG490组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量显著升高(P<0.05)；与CIA组相比，GL、GL+AG490、AG490组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量明显降低(P<0.05)。其中，GL+AG490组最为明显(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量的比较

2.3 骨痨愈康丸对模型大鼠关节软骨和滑膜组织病理学的影响

各组大鼠关节软骨和滑膜病理切片HE染色显示，Control组软骨层发育正常，厚度均匀，软骨细胞形状呈圆形，排列规则，滑膜表面光滑无增生，无炎性浸润，染色均一，组织结构完整；CIA组软骨层变薄，部分软骨细胞核染色较轻，出现组织缺损，软骨细胞减少，滑膜增厚，细胞体积增大且炎性浸润明显，组织排列紊乱；GL组软骨层大部分缺损，但细胞排列疏松，分布散乱，染色较深，滑膜表面光滑，增生较少，细胞排列整齐；GL+AG490组软骨层厚度均匀，软骨细胞较多，排列较均匀紧密，滑膜变薄，滑膜细胞减少，排列趋向整齐，染色趋向均一；AG490组组织损伤，细胞较疏松，软骨层稍厚，滑膜层细胞较少，排列均匀，结构完整，无增生，表面光滑。见图1。

图1 各组大鼠关节组织病理学变化(HE染色，×200)Fig.1 Histopathological changes in the joints of rats in each group (HE staining, ×200)

2.4 骨痨愈康丸对模型大鼠关节软骨和滑膜组织JAK3、STAT3蛋白表达的影响

免疫组化法检测结果显示，与Control组相比，CIA组软骨和滑膜中JAK3、STAT3蛋白表达显著升高(P<0.01)；经治疗后，GL、GL+AG490、AG490组软骨和滑膜中JAK3、STAT3蛋白表达由不同程度的降低(P<0.05)。其中，GL+AG490组效果最为明显。见表4。

表4 各组大鼠关节软骨和滑膜组织中JAK3、STAT3蛋白表达比较

免疫组化结果显示，Control组软骨和滑膜中阳性细胞较少，着色较浅；CIA、GL、GL+AG490、AG490组软骨和滑膜中阳性细胞由不同程度的增多。与Control组相比，CIA组软骨和滑膜中阳性细胞数量明显增多,着色较深；经治疗，GL、GL+AG490、AG490组软骨和滑膜中阳性细胞减少,着色较淡。其中，GL+AG490组软骨滑膜中阳性细胞减少最为明显。见图2、图3。

图2 骨痨愈康丸对模型大鼠关节JAK3蛋白表达的影响(×400)Fig.2 The effect of Gulao Yukang Pills on the expression of JAK3 protein in the joints of model rats (×400 )

图3 骨痨愈康丸对模型大鼠关节STAT3蛋白表达的影响(×400)Fig.3 The effect of Gulao Yukang Pills on the expression of STAT3 protein in the joints of model rats (×400)

2.5 骨痨愈康丸对模型大鼠关节软骨和滑膜组织中JAK3、STAT3mRNA表达的影响

与Control组相比，CIA组大鼠关节软骨和滑膜组织中JAK3、STAT3mRNA表达明显升高(P<0.01)；与CIA组相比，GL、GL+AG490、AG490组大鼠关节软骨和滑膜组织中JAK3、STAT3mRNA表达显著降低，其中GL+AG490组降低最为明显(P<0.05)，见表5。

表5 各组大鼠关节软骨和滑膜组织中JAK3、STAT3mRNA表达比较

3 讨论

RA是一种常见的自身免疫性疾病，属于中医“痹证”范畴，《素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”其中寒、湿二邪在RA发病过程中尤为重要。寒性收引凝滞，阻滞经脉，气血痹阻，表现为关节冷痛、僵硬；湿性重浊黏滞，阻碍气血，运行不畅，表现为肢体疼痛重着。寒湿夹杂，而致RA病情反复，缠绵难愈。《济生方·痹》曰：“皆因体虚，腠理空虚，受风寒湿气而成痹也。”指出正气虚弱为RA发生的根本原因；《黄帝内经·素问·直解》曰：“痹，闭也，血气凝涩不行也。”说明瘀为RA对关节破坏的关键因素[8]。祖国医学[9]认为多虚多瘀是RA特点，肾虚为本、血瘀为标，以补肾通络法为更本治疗法则。基于此治则研制骨痨愈康丸，本方由鹿角霜、全蝎、肉桂、蜈蚣、龟板、黄芪、鸡血藤、三七、阿胶、炮姜、清风藤、甘草、大枣组成，具有补肾活血、通络止痛之功效。骨痨愈康丸在减轻RA患者临床症状、改善骨质破坏、延缓病情发展等方面有独特的疗效[10]。

Janus激酶/信号转导和转录激活因子信号通路(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)作为应激的炎症信号通路在RA炎症反应中有着重要的调节作用，与关节软骨和滑膜联系尤为密切，在RA的发病过程中有着重要影响，是近年来对于介导细胞因子信号转导方面研究较多的信号通路[11-12]。Janus激酶(JAK)是一类细胞内非受体酪氨酸激酶，通过与信号转导和转录激活因子(STAT)的相互作用，在细胞因子受体信号通路中发挥重要作用。JAK3/STAT3信号通路与多种免疫性炎症性疾病的发病机制有关，广泛参与RA关节滑膜组织增生、血管翳形成、炎症反应、细胞凋亡等病理过程[13]。

现代医学[14]认为RA的发病机制与免疫细胞(T细胞、B细胞等)和细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α等)密切相关，细胞因子刺激关节滑膜组织，诱发炎症反应。TNF-α、IL-6、IL-17等促炎细胞因子在RA的发病机制中有着至关重要的作用。TNF-α通过激活靶细胞诱导炎症反应并且与IL-6协同刺激B细胞和T细胞，促使分泌细胞免疫球蛋白，促使RA的发生；IL-17在RA的发展过程中一直处于较高水平，推动RA病情的发展[15-16]。JAK3作为JAK/STAT信号通路的重要组成部分，在免疫性疾病的发展过程中一直扮演着重要的角色，具有促进淋巴细胞的增殖和抗炎作用，JAK3功能紊乱或缺失会导致淋巴细胞免疫功能的丧失[17]。STAT3作为RA发病的起关键致病因子，具有抑制成纤维细胞的凋亡、促进血管生成的作用。STAT3功能紊乱会促进RA滑膜细胞增殖、血管翳生成、炎症反应加剧，进一步损害关节软骨[18]。

本研究结果显示，与CIA组相比，GL、GL+AG490组通过4周骨痨愈康丸灌胃治疗，模型大鼠关节畸形程度减轻，活动度增加，能够明显降低模型大鼠足趾肿胀度，有效缓解RA的症状；同时能够显著降低模型大鼠血清中促炎因子水平，减轻RA对关节的炎性刺激。通过病理切片显示，经过骨痨愈康丸的治疗，模型大鼠关节软骨侵蚀减轻、滑膜细胞减少、滑膜层变薄，有效减轻了RA对关节滑膜和软骨侵蚀与破坏，具有保护关节的作用。经免疫组化与RT-PCR实验分析得出骨痨愈康丸能够有效下调JAK3、STAT3蛋白及mRNA的表达，抑制JAK3/STAT3信号通路的激活，与JAK受体酪氨酸激酶抑制剂AG490具有相同的作用。

综上所述，骨痨愈康丸可能通过抑制TNF-α、IL-6、IL-17的表达来降低诱导炎症反应，抑制激活JAK3蛋白，进而阻断与STAT3的激活与磷酸化，降低STAT3蛋白活性，抑制RA的进一步发展。骨痨愈康丸可能通过下调JAK3、STAT3蛋白及mRNA表达，参与JAK/STAT信号通路的调控，从而减轻RA对关节软骨的侵蚀、抑制滑膜增生、减轻关节炎症反应。这可能是骨痨愈康丸防治RA的机制之一，但具体分子生物学机理仍需更深入的研究。