支气管哮喘急性发作期患者呼吸道菌群特征及血清MD-2水平、EOS%变化

王菲，钱萌，欧阳怡，薛晓婕

支气管哮喘急性发作(acute exacerbation of bronchial asthma，AEBA)在世界范围内影响了0.3%～9.2%的人群，且发病人数仍以较高速率增长[1]。研究证实，细菌感染是继呼吸道合胞病毒感染之后诱发AEBA的第二大因素，且细菌感染诱发的AEBA患者存在更高复发率[2]。临床评估细菌感染类型对指导早期经验性选择抗生素有积极作用。临床研究证实，以髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2，MD-2)为靶点治疗脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的相关疾病效果明显，而LPS则主要存在于革兰阴性菌细胞壁[3]。嗜酸性粒细胞(eosinophilia，EOS)同样对LPS有调控作用，其水平变化与LPS直接相关[4]。现分析不同细菌感染类型AEBA患者血清MD-2、EOS%表达水平变化，以寻找两者鉴别细菌感染类型的临界点，为临床早期用药提供指导，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年8月—2022年2月鄂东医疗集团市中心医院/湖北理工学院附属医院呼吸内科收治的AEBA患者94例为观察组，男53例，女41例，年龄45～68(56.63±5.27)岁。另选取同期医院健康体检者94例为健康对照组，男50例，女44例，年龄43～69(55.39±5.44)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(KY202007-32)，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：观察组患者均符合支气管哮喘诊断标准[5]，急性发作期，且诱因为呼吸道细菌感染；健康对照组体检结果无异常，无支气管哮喘史及家族遗传史；年龄>18岁，<70岁；近1个月未服用抗生素、激素等影响呼吸道生态环境的药物。(2)排除标准：合并结核病、急性心力衰竭；肝肾功能异常；病毒感染、肺炎支原体感染；呼吸道畸形；妊娠期、哺乳期女性；合并自身免疫性疾病；合并其他肺部疾病；肺部发育不良。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 检测呼吸道菌群分布特征：受试人员清晨以生理盐水漱口，用力咯出深部痰送检；标本接种于巧克力平板、血平板、中国蓝平板，其中中国蓝平板置于培养箱(35℃)培养，巧克力平板、血平板置于二氧化碳孵箱(35℃)培养，48 h后观察，挑取单个菌落进行革兰染色，以细菌生化鉴定管(杭州天和微生物试剂有限公司)进行鉴定。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.3.2 临床资料收集：通过问卷调查方式收集AEBA患者临床资料，包括性别、年龄、哮喘病程、病情程度、合并症、吸烟史、鼻炎史等，记录是否存在侵入性操作；检测第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV1)、呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide，FeNO)；检测血清降钙素原(procalcitonin，PCT)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、血总免疫球蛋白E(total immunoglobulin E，TIgE)、白细胞计数(white blood cell count，WBC)水平；以急性发作期哮喘感知控制力问卷评估其控制力，共11个条目，每项1～5分，分值越高表明控制力越好。

1.3.3 血清MD-2及EOS%检测：观察组入院时、健康对照组体检时抽取受试人员晨起空腹肘静脉血6 ml分为2份，每份3 ml，1份离心提取上层血清，另1份血液样本肝素抗凝。取血清样本根据酶联免疫法试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)顺序每孔加入50 μl终止反应，于Aurora-600型酶标仪(杭州海沛仪器有限公司)调至450 nm处，5 min后测量光密度，绘制标准曲线，计算浓度值。采用全自动贝克曼五分类血细胞分析仪检测EOS，计算EOS%。

1.4 病情程度判定标准[6]轻度：步行或上楼时气短，呼吸频率稍微增加，肺通气功能、血气检查正常；中度：稍微活动偶感气促，讲话有中断，呼吸频率增加明显，可闻及哮鸣音，有三凹征，血氧饱和度91%～95%，呼气峰值流速障碍预计值60%～80%；重度：休息时气短，端坐呼吸，呼吸频率>30次/min，有三凹征，可闻及哮鸣音，心率>124次/min，血氧饱和度≤90%，血气pH降低。

2 结 果

2.1 AEBA患者呼吸道菌群分布特征 AEBA患者94例共分离细菌102株，其中革兰阴性菌74株(72.55%)，包括流感嗜血菌22株(21.57%)、卡他莫拉菌17株(16.67%)、感染大肠埃希菌13株(12.75%)、肺炎克雷伯菌11株(10.78%)、铜绿假单胞菌6株(5.88%)、阴沟肠杆菌3株(2.94%)、鲍曼不动杆菌2株(1.96%)；革兰阳性菌28株(27.45%)，包括肺炎链球菌18株(17.65%)、金黄色葡萄球菌6株(5.88%)、表皮葡萄球菌3株(2.94%)、肠球菌1株(0.98%)。单纯感染革兰阴性菌患者63例，单纯感染革兰阳性菌患者26例，同时感染革兰阴性菌、革兰阳性菌患者5例(流感嗜血菌与肺炎链球菌3例，卡他莫拉菌与金黄色葡萄球菌1例，卡他莫拉菌与肺炎链球菌1例)。

2.2 不同类型细菌感染患者临床资料比较 剔除同时感染革兰阴性菌、革兰阳性菌的患者5例。革兰阴性菌感染者病情程度重度比例及血清MD-2、EOS%、PCT水平高于革兰阳性菌感染者，控制力评分低于革兰阳性菌感染者(P<0.05)，见表1。

表1 革兰阴性菌与革兰阳性菌感染AEBA患者临床资料比较

2.3 2组血清MD-2、EOS%比较 观察组血清MD-2、EOS%均高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 健康对照组与观察组血清MD-2、EOS%水平比较

2.4 不同病情程度AEBA患者血清MD-2、EOS%比较 观察组94例患者轻度35例，中度37例，重度22例，血清MD-2、EOS%水平随病情程度加重而升高(P均<0.01)，见表3。

表3 不同病情程度AEBA患者血清MD-2、EOS%比较

2.5 AEBA患者血清MD-2、EOS%与病情程度的相关性 Spearman相关性分析结果显示，血清MD-2、EOS%与AEBA患者病情程度均呈正相关(r=0.842、0.846，P均<0.001)。

2.6 不同细菌感染类型危险因素分析 将病情程度、血清MD-2、EOS%、控制力评分、PCT进行多重共线性检验，发现MD-2、EOS%水平与病情程度存在多重共线性(VIF>5)，手动移除病情程度。以不同细菌感染类型为因变量(赋值：革兰阴性菌=1，革兰阳性菌=0)，以血清MD-2、EOS%、控制力评分、PCT为自变量(均以实际值进行赋值)，多因素Logistic回归分析结果显示，EOS%高、血清MD-2高是AEBA患者感染革兰阴性菌的危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 不同细菌感染类型危险因素分析

2.7 血清MD-2、EOS%鉴别AEBA患者细菌感染类型的价值 绘制ROC曲线结果显示，血清MD-2、EOS%及二者联合鉴别AEBA患者细菌感染类型的曲线下面积(AUC)分别为0.778、0.772、0.877，二者联合鉴别效能大于单项指标(Z/P=2.118/0.034、2.366/0.018)，见表5、图1。

表5 血清MD-2、EOS%鉴别AEBA患者细菌感染类型的价值

图1 血清MD-2、EOS%鉴别AEBA患者细菌感染类型的ROC曲线

3 讨 论

AEBA在世界范围内均较常见，有数据显示[7]，2018年我国≤19岁支气管哮喘患者病死率为2.3%。相关研究认为[8]，哮喘发作次数、住院史、鼻部结构异常、家里养动物是支气管哮喘患者合并感染的危险因素，细菌感染是导致AEBA发生及病情进展的重要诱因。一项研究显示[9]，64例AEBA患者中有29例为细菌感染所致，而检测到最多的病原微生物为流感嗜血菌。本研究细菌培养结果显示，分离最多的菌株同样为流感嗜血菌，其次为肺炎链球菌、卡他莫拉菌，其中革兰阴性菌明显更多。支气管哮喘合并细菌感染患者多存在黏液分泌增加、支气管黏膜肿胀症状，进一步造成气道狭窄，促使呼吸困难加重。支气管黏膜感染细菌后通过辅助T淋巴细胞及相关因子增加气道高反应性，可直接导致哮喘再次发作；同时细菌还可通过神经调节机制、免疫机制诱发哮喘。另外，细菌感染会产生黏膜变应性炎性反应，分泌大量白介素，形成细胞因子风暴现象，提高免疫性疾病发生风险。因此，对细菌感染诱发的AEBA患者应积极控制呼吸道微生态平衡，而及早明确细菌类型对指导临床经验性用药有一定帮助。既往主要采用细菌培养明确细菌感染类型，但该检测方法具有明显滞后性，主要用于后续治疗中将早期经验性抗生素更换为敏感度更高的抗生素，而对早期经验性用药无直接帮助，选择可及早鉴别细菌类型的客观指标具有临床价值。

MD-2与哮喘常见过敏原尘螨具有结构、功能同源性，可通过与Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)复合物直接作用而介导信号转导，相关研究证实[10]，MD-2可调节气道上皮细胞、树突状细胞炎性因子，对尘螨诱导的过敏性哮喘有保护作用，是临床治疗哮喘的新靶点。已有临床研究证实[11]，抑制MD-2可通过抑制TLR4信号通路减轻氧化应激及炎性反应。本研究发现，观察组血清MD-2水平明显较健康对照组高，且随病情程度加重其水平呈上升趋势，提示血清MD-2对AEBA发生、进展有促进作用。进一步分析发现，感染革兰阴性菌的患者血清MD-2水平明显更高，这可能与革兰阴性菌细胞壁中含有较多LPS有关。既往研究认为[12]，LPS可与其结合蛋白相结合，在MD-2辅助下传递信号至TLR4，诱导TLR4低聚化，形成LPS信号细胞内传导。但近年来相关报道指出[13]，MD-2不仅能增强TLR4识别LPS，其本身作为LPS联系TLR4的桥梁还具有重要调控作用。MD-2分子结构含有LPS及TLR4的独立结合区，分别为N末端TLR4结合区、C末端LPS结合区，其既能直接结合LPS形成LPS/MD-2复合体再与TLR4结合，也能先和TLR4结合形成TLR4/MD-2复合体再与LPS结合，但其最终结果均为LPS/TLR4/MD-2复合体，而TLR4真正意义上的配基并非单独的LPS，而是LPS/MD-2复合体[14]。临床研究证实[15]，MD-2是识别LPS的重要靶点，通过抑制MD-2治疗LPS诱导相关疾病已成为靶向治疗研究重点。因此，通过检测血清MD-2鉴别细菌感染类型具有较高敏感度、特异度，本研究发现其水平高于634.08 ng/L时提示患者可能为革兰阴性菌感染。

EOS是参与AEBA慢性炎性反应的重要细胞，具有释放细胞因子及颗粒蛋白功能，可产生炎性介质及细胞因子与自身相互作用，从而促进哮喘进展[16-18]。相关研究证实，EOS浸润深度与肺功能、气道重塑关系密切，且与胸腔气体容量、肺总量存在相关性[19-20]。本研究发现，AEBA患者EOS%存在异常高表达，且与病情程度呈正相关，证实EOS参与AEBA发生、进展过程。另外，感染革兰阴性菌AEBA患者的EOS%水平较感染革兰阳性菌患者更高，提示检测EOS%对鉴别细菌感染类型有积极作用，其原因在于EOS具有调控LPS作用。EOS可通过PPARγ信号通路降低炎性介质表达，机体感染革兰阴性菌后LPS水平提高，通过激活TLR4信号通路产生炎性介质，促使炎性反应加重，该过程中EOS%代偿性升高以减轻LPS诱导的炎性反应[21-22]。Logistic回归分析发现，血清MD-2、EOS%水平升高均是革兰阴性菌感染的独立危险因素，进一步ROC分析二者联合鉴别革兰阴性菌感染的AUC值达0.877，具有较高鉴别效能。

综上，血清MD-2、EOS%在AEBA患者体内均呈高水平表达，且与患者病情程度存在正相关关系，其中血清MD-2>634.08 ng/L、EOS%>6.24%可作为临床鉴别细菌感染类型的临界值，超过该水平提示患者为革兰阴性菌感染，便于指导临床早期经验用药。本研究不足之处在于未深入探究MD-2、EOS之间的机制关系，二者作用机制均与TLR4明显相关，在患者感染革兰阴性菌后二者是否存在相互作用可作为下一步的研究方向。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

王菲：设计研究方案，实施研究过程，课题设计，论文撰写；钱萌：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;欧阳怡：实施研究过程，资料搜集整理;薛晓婕：进行统计学分析