血液生物标志物在阿尔茨海默病早期诊断中的研究进展

董丽华 李加梅 郑加平 雷小晶

AD常伴有一种或多种认知域的损伤,是最常见的痴呆类型,约占老年期痴呆的60%～80%。《2022年中国阿尔茨海默病报告》显示:截至2019年,中国AD及其他痴呆病人人数约为1314万,约占全球数量的25.5%,已经成为导致中国居民死亡的第五大疾病,给家庭和社会带来沉重的经济和社会负担[1]。AD的典型病理学表现为β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)沉积形成神经炎性斑块、tau蛋白异常磷酸化形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)以及神经元缺失等[2]。目前对AD的诊断主要基于2018年美国国立衰老研究院和阿尔茨海默病协会(NIA-AA)的生物标志物框架[3],常用的检验方法为脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)和正电子发射计算机断层显像(PET)检测Aβ及tau蛋白的水平及沉积阳性病灶。但是CSF检测为有创性操作,病人依从性差;PET检测价格昂贵,具有一定的辐射性,可及性比较差。近年来,随着免疫磁减量、单分子免疫列阵和免疫沉淀-质谱(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MS)等生物检测技术的进步,寻找创伤性小、特异性强、灵敏度高、可重复操作且易于采集的外周生物标志物成为当前AD筛查与早期诊断研究的热点。本文回顾了近3年来AD相关外周生物标志物的研究,以期为AD的早期诊断提供新的见解。

1 AD生物标志物的发展历程

AD生物标志物的临床应用和诊断标准的制定经历了漫长的历程。1984年,美国国立神经病学与语言障碍、卒中和阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)制定了第一个AD诊断标准,即NINCDS-ADRDA诊断标准。1992年CSF中Aβ被鉴定出,这为开发AD的诊断测试和旨在减少Aβ脑沉积的治疗策略提供了新的希望[4]。1993年,Vandermeeren等[5]首次在CSF中检测到总tau蛋白(t-tau)。随后,大量的AD研究中对CSF Aβ42、t-tau和磷酸化tau蛋白(p-tau)进行了评估。2007年,国际工作组织(IWG)发布了NINCDS-ADRDA诊断标准的修订版,即IWG-1诊断标准[6]。该标准提出AD是一个连续的疾病过程,并首次将生物标志物纳入AD的诊断标准,包括PET、结构磁共振扫描(sMRI)以及CSF Aβ、t-tau、p-tau等,这将AD的诊断由临床病理诊断转变成了一个临床生物学诊断。基于CSF的AD生物标志物反映了AD潜在病理的大量临床证据,2011年,NIA-AA修订了新的NIA-AA诊断标准,提出了临床前AD的概念性框架,并将AD的发病过程更新为连续的3个阶段:临床前AD(preclinical AD)、轻微认知功能障碍(mild cognitive impairment,MCI)和AD痴呆(AD dementia)。并且每个阶段都具有相应的生物学标志物作为诊断标准,该诊断标准将AD生物标志物分为两大类:Aβ积聚的生物标志物和神经元变性或损伤的生物标志物[7]。由于AD病理生理过程的生物标志物仅用于研究中,2014年IWG进一步修订了AD的诊断标准,即IWG-2诊断标准。该诊断标准将AD生物标记物分为诊断性生物标志物(CSF Aβ、t-tau、p-tau,Aβ-PET)、AD致病基因和进展性生物标志物[sMRI和氟脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层扫描术(FDG-PET)],同时扩充了AD的分类,即前驱期型AD(prodromal AD)、典型AD(typical AD)、非典型AD(atypical AD)、混合型AD(mixed AD)[8]。

2018年,NIA-AA在指南中提出了基于Aβ(A)、病理性tau蛋白(T)及神经变性(N)生物标志物的ATN研究框架,明确地将AD从一种临床综合征转变为一种生物学定义的疾病谱系,包括AD病理改变和AD。其中,仅Aβ沉积阳性,但病理性tau阴性的病人,即A(+)T(-)(N),称为“AD病理改变”。Aβ沉积和病理性tau均阳性时,即A(+)T(+)(N),方可定义为AD[3]。ATN框架的提出,肯定了CSF检验和PET检查对AD诊断的意义。随着对AD病理认识的不断深入及更多新型标志物的出现,ATN诊断框架并不能涵盖AD的全部病理类型,因此,在ATN框架的基础上,NIA-AA又提出新的ATX(N)框架,其中“X”代表新生的候选生物标志物,并在AD诊断中重点关注外周生物标志物[9]。《阿尔茨海默病源性轻度认知障碍诊疗的中国专家共识2021》指出,血浆Aβ42/Aβ40、p-tau181、p-tau217和神经丝轻链(neurofilament light,NfL)可用于AD源性MCI的早期诊断和疾病进展的评估[10],肯定了血液生物标志物在AD早期诊断中的价值,为AD新型血液标志物的开发带来了新的希望。

2 外周血液标志物在AD早期诊断中的价值

2.1 Aβ相关生物标志物 Aβ学说被认为是AD的主要发病机制。Aβ是由跨膜蛋白β淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)经β分泌酶与γ分泌酶水解产生的含有36～43个氨基酸的肽段[11]。Aβ40和Aβ42是体内Aβ最常见的亚型,Aβ42/Aβ40可以平衡不同个体间Aβ的差异,其较Aβ42具有更好的诊断性能[12]。目前,临床上诊断AD主要依靠Aβ-PET,CSF Aβ40、Aβ42及其比值的测定。血液Aβ的检测比CSF更具挑战性,因为他们在血液中的浓度比在CSF中至少低100倍[13]。但是血液检测方便实施,且随着超敏感的IP-MS的应用,血浆Aβ的测定越来越受到关注。一项应用IP-MS技术测定血浆Aβ42/Aβ40比值的研究结果显示,血浆Aβ42/Aβ40与Aβ-PET脑扫描具有良好的一致性,可用于辅助诊断AD,能够准确识别受试者是否具有认知障碍[14]。Janelidze等[15]用8种方法检测血浆Aβ,发现与Aβ-PET阴性个体相比,Aβ-PET阳性人群中血浆Aβ42/Aβ40水平明显降低。但是,血浆Aβ42/Aβ40检测不如CSF样本稳健,不同检测方法中血浆Aβ42/Aβ40的结果存在差异。

2.2 tau蛋白相关生物标志物 tau蛋白是一种主要在中枢神经系统神经元表达的微管相关蛋白,p-tau在维持微管的组装和稳定方面具有重要作用,但其过度磷酸化发生聚集导致的NFTs是AD的标志性病理改变。Fossati等[16]研究发现,AD病人血浆t-tau水平显著升高,并且与认知水平的下降相关,可反映病情的进展程度,是AD的预后标志,但其与CSF t-tau及CSF p-tau的相关性比较微弱,目前也缺乏诊断的可靠性,并不能作为AD的特异性生物标志物。tau蛋白片段上有许多位点存在异常过度磷酸化,目前研究较多的磷酸化位点有p-tau181、p-tau217及p-tau231。

2.2.1 p-tau181:研究表明,血浆p-tau181水平在AD病程中呈逐渐增加的趋势,MCI及AD痴呆病人血浆中p-tau181的表达水平显著高于认知未受损个体,可以有效区分AD痴呆病人与无AD病理变化的其他类型痴呆[17]。另有研究发现,血浆p-tau181不仅与CSF p-tau181呈正相关,与tau-PET也具有很好的相关性,还可用于预测与AD相关的神经变性[18]。Moscoso等[19]研究发现,血浆p-tau181水平在Aβ-PET和CSF生物标志物达到异常水平之前就已经开始出现动态变化,且随着Aβ病理严重程度的增加而升高,在Aβ病理形成后5年达到异常水平;在MCI和AD痴呆受试者中,血浆p-tau181的基线水平与Aβ沉积的相关性更强,而在认知正常的受试者中,这种相关性明显较弱;除此之外,血浆p-tau181纵向增加还与6年后tau蛋白的广泛聚集相关。Lussier等[20]发现,血浆p-tau181水平在Aβ阳性和认知受损的个体以及载脂蛋白E4携带者中均升高,并且与年龄、认知能力下降、18F-FDG-PET低代谢和CSF p-tau181水平显著相关。综上,血浆p-tau181被认为是AD特异性的生物标志物之一,还可作为神经退行性病变进展的预测因子。

2.2.2 p-tau217:Palmqvist等[21]报道,血浆p-tau217区分AD和其他神经退行性疾病的准确性达96%,明显优于血浆p-tau181和NfL,且与CSF p-tau217无明显差异。同时,血浆p-tau217在鉴别tau-PET是否异常的准确性上明显高于血浆p-tau181、NfL,以及CSF p-tau181和Aβ42/Aβ40比值。在AD病人中,与非携带者相比,PSEN1突变携带者的血浆p-tau217水平显著升高,据估计,这项异常在MCI发病前约20年就已出现。我国一项荟萃分析显示:AD病人的血浆p-tau181、p-tau217和p-tau231水平明显高于MCI组及认知正常对照组,且血浆p-tau217在区分MCI和AD方面比血浆p-tau181、p-tau231更敏感[22]。Ashton等[23]最新的研究评估了多种AD血液生物标志物在AD早期阶段病人中与Aβ病理、认知功能和脑萎缩的相关性,发现仅有p-tau217浓度随着AD病人淀粉样蛋白沉积的加重而纵向增加,且p-tau217的纵向变化与AD病人认知功能的下降和脑萎缩的程度显著相关。因此,血浆p-tau217可作为临床前AD或前驱期型AD疾病进展的替代生物标志物。

2.2.3 p-tau231:Ashton等[24]的研究表明,血浆p-tau231浓度在诊断AD方面表现出较高的准确性(AUC=0.94)。在TRIAD队列中,与Aβ阴性组相比,Aβ阳性组的AD病人、MCI病人以及认知未受损老年人中血浆p-tau231水平均显著升高。而且血浆p-tau231的升高先于p-tau181和p-tau217,在Aβ少量沉积时就开始出现,是目前最早出现的p-tau类型;血浆p-tau231水平还与CSF p-tau231、tau-PET呈显著正相关,与CSF Aβ42呈负相关,被认为是新兴的AD病理学分期的生物标志物。另有研究发现,血浆p-tau231、p-tau217水平与Aβ早期沉积的PET摄取具有较强的相关性,在无明显Aβ病理改变的个体中,也同Aβ-PET摄取的纵向增加相关。因此,血浆p-tau231水平还可以反映早期Aβ改变,并作为临床前AD的Aβ病理学状态的生物标志物[25]。

2.2.4 脑源性tau蛋白(brain-derived tau,BD-tau):血清BD-tau水平与AD病人脑组织中的淀粉样斑块和tau蛋白缠结的严重程度密切相关,并表现出与CSF t-tau和CSF BD-tau相当的诊断性能。同时,血浆BD-tau还能准确地将尸检证实的AD病人与其他神经退行性疾病区分开来,准确率高达86.4%[26]。因此,血浆BD-tau或许可以用于评估AD相关的神经退行性病程。

2.3 NfL NfL是神经丝蛋白的一个组成部分,特异表达于神经细胞内,多种神经系统疾病的发生发展过程均伴随着NfL水平的改变[27]。Mattsson等[28]的研究显示,与认知正常的对照组相比,血浆NfL水平在MCI及AD痴呆病人中明显升高,具有较高的诊断准确性(AUC为0.87),且与认知损害、脑萎缩和大脑18F-FDG-PET低代谢之间存在相关性。另有研究发现,与非携带者相比,常染色体显性遗传性AD突变携带者[APP、早老素1(PSEN1)、早老素2(PSEN2)]血清NfL水平显著升高,并且在无症状携带者转化为临床认知障碍期间达到峰值,在症状携带者中达到平台期[29]。因此,血液NfL的动态变化可以作为预测家族性AD症状前阶段的疾病进展和脑神经退行性变的生物标志物。最新研究发现,与主观认知衰退(subjective cognitive decline,SCD)病人相比,MCI病人和AD病人的血浆NfL水平显著升高。此外,MCI Aβ阳性病人血浆NfL浓度高于MCI Aβ阴性和SCD Aβ阳性病人,但与AD病人差异无统计学意义。同时,MCI病人血浆中NfL水平与CSF Aβ42和Aβ42/Aβ40比值呈负相关,与p-tau、t-tau呈正相关。这表明NfL可能是AD临床前阶段有用的外周生物标志物[30]。除此之外,血浆NfL水平还与CSF NfL水平具有很好的相关性,并可用于评估神经元轴突的损伤,因此,血浆NfL也可以作为神经变性的生物标志物[28-29]。

2.4 胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP) GFAP在中枢星形胶质细胞的发育和成熟中起着重要作用,该蛋白也存在于周围神经系统的非髓鞘化Schwann细胞中。GFAP在星形胶质细胞的再生和突触可塑性中起着非常重要的作用,是星形胶质细胞增生的标志物,也是一种反映AD早期神经病理损伤的标志物。多项研究发现,与认知未受损Aβ阴性组相比,Aβ阳性组血浆GFAP浓度显著升高,在Aβ-PET阳性组中,血浆GFAP水平与Aβ-PET沉积存在显著相关性,而与tau-PET无关。与CSF GFAP相比,血浆GFAP能更好地追踪脑内Aβ的变化,更准确地识别Aβ阳性状态[31]。因此,血浆GFAP可以预测Aβ沉积和认知能力的下降,是与Aβ沉积相关的AD早期特异性标志物[32]。Chatterjee等[33]报道,血浆GFAP可区分Aβ阳性和Aβ阴性常染色体显性阿尔茨海默病(autosomal dominant Alzheimer’s disease,ADAD),与有症状ADAD者相比,无症状ADAD者血浆GFAP与Aβ负荷的关系更强,血浆GFAP水平还与神经退行性变和认知障碍的程度和发生率相关。此外,血浆GFAP水平仅在伴有Aβ病理的个体中与tau病理呈正相关[31,34]。血清GFAP对AD的诊断性能(AUC=0.84)与血清p-tau181(AUC=0.89)相当,且优于血清NfL。Oeckl等[35]的研究显示,与认知正常的对照组和行为变异型额颞叶痴呆(bvFTD)病人相比,MCI和AD病人的血清GFAP水平明显升高,在MCI转化为痴呆的病人中,其血清GFAP水平明显更高。因此,血液GFAP水平可能是AD和bvFTD鉴别诊断的一个很有前途的候选生物标志物,也是MCI向痴呆转化的一个很好的预测指标。GFAP水平在其他神经变性疾病中也会升高,将血液中的GFAP作为神经退行性疾病的生物标志物,特别是与其他标志物结合使用,是提高鉴别诊断精度的一个很有前景的方法。

2.5 神经源性外泌体(neural-derived exosomes,NDEs)突触损伤相关标志物 突触是学习和记忆的基本结构,突触的缺失与认知能力下降有一定的相关性,一些突触功能障碍的生物标志物也与AD有关[36]。生长相关蛋白43(growth-associated protein 43,GAP-43)是突触前膜的钙调素结合磷蛋白,主要定位于成人海马区和联合皮质区,并在神经元发育和突触形成过程中高度表达,参与调节轴突生长、突触可塑性以及学习和记忆功能[37]。突触结合蛋白-1(synaptotagmin-1,Syt1)是对胞吞有着双向调控的Ca2+感受器,可通过调节膜的弯曲程度精确调控胞吞-胞吐之间的偶联平衡[38]。神经颗粒素(neurogranin,NRGN)是一种突触后蛋白,在海马、尾状核和杏仁核等的树突棘中高度表达,参与钙信号调节和突触可塑性,在长时程增强中起重要作用[39]。研究表明,在有症状的AD病人中,CSF突触生物标志物会增加,并能准确地将有症状的AD与其他痴呆症区分开来[36]。

血液中反映突触功能障碍的生物标志物往往无法反映大脑的损伤情况,在血浆中直接检测突触生物标志物的性能并不理想。而血浆NDEs是从中枢神经系统衍生出的,能较为特异性地反映中枢神经系统生物标志物的水平。NDEs是神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞分泌的细胞外囊泡,在神经系统中通过其多种信号功能参与神经元的发育、维持和信息交流[40]。Jia等[41]对5～7年前认知功能正常的人群进行随访研究,发现AD与MCI受试者血清中NDEs突触相关蛋白GAP43、突触相关蛋白25、Synaptotagmin1和Neurogranin水平显著低于健康对照组,且与CSF中相应蛋白的表达高度相关,作为认知障碍出现前5～7年预测AD和MCI的生物标志物,其准确率高达87%～89%。这些NDEs能穿过血脑屏障[40],在一定程度上反映了大脑的病理变化,被认为是AD生物标志物的理想候选。

2.6 其他 Flotillin蛋白是位于细胞内和细胞外囊泡中的疏水蛋白,主要参与信号转导和膜蛋白的相互作用。Flotillins通过影响APP内吞作用和加工、钙稳态、神经元凋亡、线粒体功能障碍、Aβ诱导的神经毒性,在AD的发病机制中发挥作用[42]。Abdullah等[43]研究发现,AD病人血清Flotillin蛋白水平较非AD病人显著降低,PET检查出现Aβ沉积的MCI病人较未出现Aβ沉积病人的Flotillin蛋白水平也显著下降。除此之外,血清Flotillin水平还与脑内PET检查的Aβ沉积即标准化摄取值比值(standard uptake value ratio,SUVR)呈负相关,与MMSE评分呈正相关,因此,血清Flotillin蛋白的测定有助于AD-MCI及AD的早期诊断。

3 总结与展望

早在临床症状出现前的20～30年,AD的病理过程就已经开始,因此,AD早期,尤其是临床前AD可能是未来AD干预的重要节点,早筛查、早发现、早诊断、早干预已成为AD防治的重要策略和共识。本文总结了近3年报道的AD外周血中潜在的生物标志物,这些标志物在临床诊断AD中尚未得到一致认可,仍然存在一些问题[11]:(1)含量较低。来自中枢的一小部分生物标志物通过血脑屏障、蛛网膜颗粒、类淋巴系统和血管系统进入外周血中,进而在血液系统中被进一步稀释;同时,这些外周血生物标志物也可以被蛋白酶降解或与血液蛋白、血细胞等结合形成复合物,从而阻碍了标志物的准确测定。(2)产生和清除受到干扰。部分外周血生物标志物在肝、肾等组织器官中被巨噬细胞清除,并且外周组织也可产生并释放相同的标志物到血液系统中。(3)水平存在波动。由于新陈代谢、饮食和药物以及其他因素的影响,外周血液生物标志物的水平在不同个体之间存在差异,并且在整个AD疾病谱中是动态变化的。

目前,临床上基于血液的AD生物标志物是对CSF和神经影像生物标志物的补充,可用于筛查和随访病人,实际临床应用仍需要大规模的临床研究进行验证以及统一血液生物标志物的检测方法和阈值。AD的发生发展是一个极其复杂的过程,AD进程中生物标志物发生动态变化,单一生物标志物难以描述AD全谱,多个生物标志物的联合检测不仅能显著提高AD的早期诊断,也能为疾病的进展、治疗以及预后提供重要依据。因此,寻找创伤性小、特异度强、灵敏度高的AD早期甚至超早期血液生物标志物组合以及在不同的临床中心之间建立AD生物标志物的统一标准,可能是未来研究的重点和热点。