新工科背景下应力加载系统功能提升思路的探讨

徐志玲*，刘万钱，祝连彩，郝石磊

（1.重庆大学生物流变科学与技术教育部重点实验室 重庆 400030;2.重庆大学生物工程学院 重庆 400030）

新工科建设通过新兴学科建设引领专业建设，实现学科建设与专业建设的联动发展，以及推动新兴交叉融合学科建设，致力于培养创新型的卓越工程人才[1]。新工科背景下，专业人才培养要放在科技创新最优先的位置[2]。生物流变科学与技术教育部重点实验室是专业人才培养的重要平台和基地。随着科技创新的持续推进，实验室内大型仪器设备的性能更新很快，大型仪器设备应与专业紧密结合，满足相关专业科研发展的需求。应力加载系统平台可模拟体内细胞的真实受力自然环境，为体外细胞提供类似人体内的生理环境，并在牵张拉伸应力作用下诱导细胞发生生化，生理变化包括细胞增殖、凋亡、衰老、分化、癌变等，进而阐释细胞力学信号转导机制和相关通路的基因表达调控机理等。该设备已为实验室的科学研究、生物医学工程专业领域的创新型人才培养和社会服务等提供了重要保障。新工科建设背景下，如何提升设备的使用效益，与高校学科建设、科研水平、教学质量等密切相关[3]。因此，厘清应力加载系统功能提升的建设思路，具有重要指导意义。

1 应力加载系统服务功能的局限性

实验室现有的应力加载系统版本很低，其固有功能仅是对体外培养细胞施加一定幅度、频率的周期性应力刺激，诱导细胞发生生理生化反应[4]。目前，该设备的很多重要功能都无法实现，如静动态对比实验、共培养实验等。基于新工科对交叉学科专业科研创新的重要需求，充分发挥该仪器设备原有的功能，尽可能做到“物增其用”，开发和拓展该仪器设备的功能和应用范围，提升科研、教学和社会服务价值，是非常有必要的。

2 应力加载系统功能的提升途径

实验室在原有的应力加载系统周期性牵张的固有功能基础上，配置共培养装置、动态对照隔离阀、细胞居中种植器，不仅可以拓展和完善细胞应变范围，开展共培养状态下细胞形态、功能、生命周期的变化研究，而且还可以对同一批样品中细胞受力和不受力进行动态、静态培养的对照（图1）。

图1 应力加载系统的新功能开发后的技术路线

3 应力加载系统功能提升内涵

3.1 细胞居中种植器

应力加载系统的加载原理是孔中心的圆形塑料元件顶着膜，膜周围的环形空腔连接仪器造成真空，膜周围环形一圈向下吸引，膜中间圆形区域的细胞受到径向牵拉。原有的细胞接种方式是覆盖整张膜，牵张应力加载之后，只有仍在中心区域的细胞才能受到均匀的应变，而周围细胞受力不均匀。但在收集蛋白或RNA样品时，所有细胞是一起收集的，细胞的力学刺激状况复杂，可能影响后期蛋白水平、基因水平等方面的检测结果。细胞居中种植器主要用于细胞的居中种植，可保障所有细胞受到均匀应变，杜绝浪费细胞，保证实验结果的严谨性和准确性。

细胞居中培养实验操作方案：

①将细胞居中种植器插入基板，类似于将圆柱形加载站放入基板的方式，确保板中的孔与细胞接种器上的柱对齐，施加负压。

②种植细胞，使细胞粘附到膜上所需的播种时间至少两个小时。

③每孔缓慢加入1 ml新鲜培养基以增加体积，以便正确吸出非贴壁细胞。然后，在每个孔的侧面插入一个吸气器尖端，并吸出含有非贴壁细胞的介质。

④每孔加入3 ml新鲜培养基，然后将培养板放回培养箱，直到准备好进行加载应变。

3.2 动态对照隔离阀

隔离阀可进行细胞静动态培养实验，使同一培养板内，部分孔内细胞受力进行牵张应变，部分孔内细胞不受力进行静态生长，可对比同一环境下细胞的静态培养与动态培养，降低实验成本。换句话说，隔离阀能够在单独的六孔板上阻断某一个或几个孔的真空吸引力，从而在一个六孔板中同时设置实验组和对照组。而以往实验中，需要六个孔进行同样的处理，对照组需要额外取一个六孔板种细胞来做，也增加了耗材成本。

动静态细胞培养实验操作方案：

为防止对单个孔的底部施加真空压力，为培养细胞创造一个不受约束的受控环境，同时对同一板内的其他培养物施加应变，形成细胞动态牵张与静态对比。

在细胞接种之前，取出隔离阀，拔出销钉，放入培养板底部，并使其附着在膜表面，确保隔离阀每一侧的两个气孔都暴露在外，并且没有被推过培养板孔的底部边缘，然后将销钉推回穿过塞子的气孔，直到销钉头碰到隔离阀的侧面。

3.3 细胞Transwell共培养装置

使用标准Transwell进行共培养或细胞迁移测定，可以实现以下功能：在存在或不存在机械负荷的情况下培养两种不同的细胞类型；隔离机械负载的直接和自动/旁分泌效应；检查底物菌株对细胞迁移的旁分泌/自分泌影响；检查药物运输以响应机械负荷的旁分泌效应；分析细胞极化层的形成，以响应机械负载带来的旁分泌效应等。如果将Transwell共培养体系引入力学加载平台，对于细胞力学研究尤其是骨关节力学方向的研究具有重大意义。以往只能单独测试力学刺激对某种细胞造成的影响，不知道受到力学刺激后细胞的外分泌物对同培养体系其他细胞的影响，而骨关节系统里就是多种组织、多种细胞类型存在于一个环境中的。

细胞Transwell共培养实验操作方案：

细胞Transwell共培养装置，可使其位于生长在培养板橡胶膜底部的下层细胞单层之上。Transwell装置可在培养板内进行共培养、细胞迁移测定、细胞极性测定、细胞趋化性和侵袭性等实验，从而检测来自应变细胞的促分泌素对Transwell中未应变细胞的影响。Transwells也可以作为应变样品在同一孔中的非应变对照。使共培养装置位于生长在培养板橡胶膜底部的下层细胞单层之上，然后放入Transwell孔板，以小鼠MSCs细胞迁移实验为例：①将细胞加入10 ml含有20%FBS和1.3%DMSO的培养基中。②在37℃、5%CO2下孵育5―7天，使细胞能够迁移。③将100微升制备好的水凝胶添加到6.5 mm直径Transwell的上腔室中，确保水凝胶均匀涂抹并形成凝胶。④离心活化的细胞并重悬于培养基中。稀释至1.5 106个细胞/ml的密度。⑤将100微升悬浮液添加到上腔室中。⑥将拟定的化学引诱剂添加到下室。⑦在37℃、5%CO2、100%湿度下孵育2小时。⑧从Transwell中取出上清液并用PBS轻轻冲洗。⑨添加细胞检测试剂（例如钙黄绿素等）并使用适合所选检测试剂的方案对迁移到水凝胶中的细胞进行定量。

基于以上分析，在充分发挥现有仪器功能和确保实验安全的前提下，细胞居中种植器、动态对照隔离阀、细胞Transwell共培养装置不仅扩展了应力加载系统的功能，还可以提高科学研究水平，节省科研经费和降低科研成本，这对应力加载系统仪器的功能开发与提升具有重要意义，而且已有研究证明，三种装置均可有效用于细胞应力加载实验[5]。

4 结语

应力加载系统历经十几年的运行服务，实验室通过增添新功能附件，实现了对现有系统的升级增配、扩展与完善，可进一步明确生物力学等因素在人体正常生理情况下以及相关病变发生发展过程中的作用，可为疾病预防、治疗提供更多的具有生物力学特色的新技术、新方法和新思路。同时未来将该设备功能提升所产出的高水平科研成果和高新技术及时转化到实验教学中，契合科研反哺教学机制，积极将科研优势转化为教学优势，以期在此项目基础上培育生物医学工程领域优秀的科研成果和教学成果，最终提高生物医学工程领域专业人才培养质量。