毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因PtHDT902在叶枯病应答反应中的功能1)

程婷

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

关韬 赵晓 马旭俊

(国家林业和草原局重点国有林区森林资源监测中心)(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学))

杨树是重要的工业用材树种。杨树优良品种的选育和通过遗传改良来提高杨树抗逆性和抗病性对于生产具有重要意义[1-2]。杨树叶枯病主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南等地，可以危害毛白杨、小叶杨、小青杨、银白杨、北京杨等多种杨树叶片[3]。链格孢菌是杨树叶枯病的病原菌。该菌主要侵害杨树的叶片和幼嫩的枝梢,造成叶片枯黄,枝梢死亡等[4-5]。目前对该病的防治并没有非常有效的措施，主要是化学防治，这存在环境污染、生态系统平衡的破坏等弊端[6-7]。因此，筛选并鉴定抗病基因，明确其在抗病过程中的功能及其抗病分子机理，不仅有利于杨树抗叶枯病机制的研究，而且能为杨树育种提供候选基因[8-9]。

当植物受到病原微生物的侵害时，会通过改变细胞代谢以及激活防御基因的表达来诱发某种防御机制以抵御病原菌带来的危害[10]。在植物对病原菌的防御过程中，SA和JA等植物激素起关键的调节作用。PR为病程相关基因，LOX和JAZ10等常被作为检测JA防御应答的标记基因[11]。研究植物受到病原微生物侵害时关键应答基因的功能以及参与的防御机制对提高植物的抗病性具有重要意义。

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)催化组蛋白去乙酰化，参与组蛋白乙酰化状态的调控，调节基因的转录[12]。草本植物中的研究表明，HDAC家族基因过量表达或敲除，能够影响植物体内组蛋白乙酰化水平，调节植物的抗病性[13-14]。在前期研究中，我们从毛果杨(Populustrichocarpa)中克隆了一种HD2类型的组蛋白去乙酰化酶基因PtHDT902，并将该基因导入84K杨(Populusalba×Populusglandulosa)中，使该基因过量表达[15-16]。在此基础上，本研究通过检测链格孢菌、SA和MeJA对毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因PtHDT902表达的影响，以及分析在接种链格孢菌后野生型和PtHDT902转基因84K杨叶片的表型，明确PtHDT902在杨树叶枯病应答反应中的功能。此外，分析了PtHDT902对抗病防御相关基因表达的影响，为进一步阐明PtHDT902作用的分子机制以及植物抗病育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种和植物材料

链格孢菌(A.alternata)购自中国林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)。

野生型毛果杨、野生型84K杨和PtHDT902转基因84K杨(转基因植株的获得见参考文献[15]、[16])组培幼苗来自本实验室，均在(25±2)℃，16 h光照/8 h黑暗的条件下培养。

1.2 链格孢菌的培养和孢子悬浮液的制备

用PDA培养基培养病原菌，25 ℃，培养15 d。向平皿内加入20 mL无菌水制备孢子悬浮液，在无菌漏斗中从上至下依次铺入300、400及500目的过滤网进行过滤。用血球计数板计算孢子的浓度，达到2×107个/mL时，用于侵染实验。

1.3 病害程度分级

根据菌斑面积大小将受害程度分为3个等级：Ⅰ级是菌斑面积≤0.1 cm2，Ⅱ级是0.1 cm2<菌斑面积≤0.3 cm2，Ⅲ级是菌斑面积>0.3 cm2。

1.4 植株激素处理和链格孢菌接种

选取生长状态一致的、健壮的1月龄野生型毛果杨幼苗进行链格孢菌和激素处理。在链格孢菌侵染试验中，选取植株的第2～3片叶剪下来放在湿润的滤纸上，每个平皿放4片叶，在主叶脉两侧各滴10 μL孢子悬浮液，对照组则滴10 μL无菌水。每个株系对照三皿，处理三皿。接种后的叶片在25 ℃，16 h光照/8 h黑暗的环境中培养，培养时间分别为0、3、12、24和48 h。在激素处理试验中，将植株分别在含有200 μmol/L SA和200 μmol/L MeJA的水溶液中培养，培养时间为0、4、6和12 h。选取长日照条件下生长状态一致的1月龄84K杨野生型(WT)和PtHDT902转基因株系Tr-1和Tr-2各6株进行链格孢菌侵染试验。接种过程同毛果杨，培养7 d。侵染实验重复3次。

处理时间结束后收集植物的叶片，经液氮冷冻后保存于-80 ℃。用于后续基因表达分析。

1.5 毛果杨PtHDT902基因的表达分析

采用pBIOZOL试剂(BioFLUX)提取上述1.4中保存的叶片总RNA，利用PrimeScript TM RT Reagent Kit(TaKaRa)试剂盒将总RNA反转录为cDNA。

利用qRT-PCR技术，分析SA、JA和链格孢菌处理不同时间时PtHDT902基因的表达量。qRT-PCR反应体系为：TBGreenPremixExTaq(TliRNaseHPlus)(2×)(TaKaRa)10 μL，PtHDT902基因的上下游引物(见表1)(10 mmol/L)各0.8 μL，模板cDNA(10～12.5 ng)2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每个样品进行3次重复。以18S rRNA(18S)作为内参基因，引物序列见表1。利用2-ΔΔCt方法分析，PtHDT902基因在非处理条件下的表达量设定为1，处理后基因的表达量是相对于非处理的相对值。PCR仪为德国耶拿qTOWER3GCycler荧光定量PCR仪。

1.6 细胞学染色

野生型和PtHDT902转基因84K杨的叶片在接种链格孢菌7 d后进行细胞学染色，分析叶片的抗病性。(1)二氨基联苯胺(DAB)染色。叶片在1 g/L(pH=3.8)的DAB溶液中染色过夜，用乙醇进行脱色去除叶绿素；(2)台盼蓝染色。叶片置于乳酚(V(苯酚)∶V(甘油)∶V(乳酸)∶V(水)=1∶1∶1∶1)和2.5 g/L的台盼蓝染色液中煮沸2 min，待叶片冷却后，用12.5%的水合氯醛溶液进行脱色去除叶绿素；(3)苯胺蓝染色。叶片在V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1中固定并脱色去除叶绿素，然后用0.1%苯胺蓝(溶于100 mmol/L K2HPO4，pH=8.5)染色。将脱色后的叶片置于10%水合氯醛溶液中保存，在光学显微镜下观察。

1.7 抗病防御相关基因的表达

为了明确PtHDT902在抗病防御体系中的作用，分析了野生型和PtHDT902转基因84K杨植株中LOX、JAZ10、PR4、PR1-1、POD、SOD、CAT-1和CAT-2基因的表达情况。PCR反应体系为2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)10 μL、上下游引物(10 mmol/L)各1 μL、模板cDNA 25 mg/L、ddH2O加至20 μL。PCR反应程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。表1为引物序列。

表1 PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 毛果杨经链格孢菌和激素处理后PtHDT902的表达

链格孢菌接种3 h即能诱导PtHDT902基因的表达，在接种12 h时表达量达到最高，约是处理前表达量的8倍，之后开始下降，在48 h时接近于初始值(表2)。SA和MeJA处理均能诱导PtHDT902基因的表达。SA处理4 h就能诱导PtHDT902的表达，处理6 h时表达量达到最高，约是处理前表达量的8倍，之后开始下降(表2)。MeJA处理也能诱导PtHDT902基因的表达，在MeJA处理4 h时表达量达到最高，约是处理前表达量的4倍，之后逐渐下降(表2)。这些结果表明，PtHDT902的表达受链格孢菌、SA和MeJA的诱导。

表2 链格孢菌和激素处理后PtHDT902的表达

2.2 PtHDT902过量表达降低84K杨叶片对链格孢菌的抗性

接种链格孢菌7 d后，PtHDT902转基因84K杨植株叶片形成的菌斑面积明显大于野生型(图1)。根据菌斑面积大小，对野生型和PtHDT902转基因植株叶片病害程度分级，野生型植株叶片产生22个Ⅰ级病斑，产生2个Ⅱ级病斑，而转基因株系Tr-1和Tr-2叶片产生Ⅰ级病斑的个数分别为5和10个，产生Ⅱ级病斑的个数分别为13和14个，产生Ⅲ级病斑的个数为6和0个(表3)。这些结果说明，PtHDT902基因过量表达降低了84K杨对链格孢菌的抗性。

图1 PtHDT902转基因84K杨叶片接种链格孢菌后的表型

表3 PtHDT902转基因84K杨叶片接种链格孢菌后受害程度分级

2.3 PtHDT902转基因84K杨叶片对链格孢菌的抗病性测定

接种链格孢菌7 d后，对叶片进行DAB、台盼蓝和苯胺蓝染色。与野生型相比，转基因植株染病叶片产生的棕红色斑点数量较多，颜色较深，积累较多的活性氧(图2A)，死亡细胞数目明显增加(图2B)，菌丝的积累明显增多(图2C)。这些染色实验结果表明，PtHDT902转基因84K杨植株的叶片对链格孢菌的防御能力降低。

A为DAB染色；B为台盼蓝染色；C为苯胺蓝染色，放大4倍。

2.4 PtHDT902对相关基因表达的影响

在所研究的基因中，PR1-1、PR4、LOX和JAZ10的表达受PtHDT902的调控。与野生型植株相比，PtHDT902转基因84K杨植株叶片接种链格孢菌后，病程相关抗性基因PR1-1和PR4的表达均显著降低；JA合成相关基因LOX的表达水平明显下调，而JA合成途径的抑制因子JAZ10在转基因植株叶片中的表达水平上调(图3)。我们还分析了活性氧清除相关基因的表达，发现活性氧清除相关基因SOD、POD和CAT的表达无明显变化(图3)。这些结果表明，PtHDT902可能通过调控JA的合成来调控JA信号反应，进而调控植株对链格孢菌的响应，而不是通过调节活性氧的清除来调节杨树对链格孢菌的响应。

图3 胁迫相关基因的表达水平

3 结论与讨论

木本植物HD2类型的组蛋白去乙酰化酶在生物胁迫应答反应中的功能还不清楚。我们分析了植物激素JA和SA以及链格孢菌侵染对毛果杨PtHDT902基因表达的影响。JA和SA都能诱导PtHDT902的表达，这一结果与大麦和水稻HD2基因的表达模式相近[17-18]。链格孢菌也能够诱导PtHDT902基因的表达。这些结果表明，PtHDT902参与链格孢菌引起的生物胁迫应答反应。本研究分析了PtHDT902转基因84K杨对链格孢菌的抗病性。PtHDT902过量表达降低了转基因植株对链格孢菌的抗性，病程相关抗性基因PR1-1和PR4的表达水平也降低。本研究推测，当PtHDT902被链格孢菌诱导表达后，能够通过组蛋白去乙酰化作用抑制一些抗病基因的表达，导致植株抗病性的减弱。毛果杨PtHDT902似乎是杨树叶枯病抗性的负调控因子，而PtHDT902的作用机制还有待深入研究。植物对病原菌侵染的抵御是一个复杂的过程，激素在抵御病原菌侵害中具有重要的作用[19-25]。研究中，SA和MeJA处理均能诱导毛果杨叶片中PtHDT902基因的表达。此外，链格孢菌侵染也能诱导毛果杨叶片中PtHDT902基因的表达。在野生型84K杨和PtHDT902转基因植株叶片接种链格孢菌7 d后，JA合成相关基因LOX在转基因植株中的表达量低于野生型，而JA合成的抑制因子JAZ10在转基因植株中的表达明显上升。这些研究结果表明，PtHDT902参与SA和JA信号途径来调控毛果杨对病害的防御反应。PtHDT902可能控制SA和JA信号途径中一些基因的表达，使植物对病害做出适度的反应，控制防御反应处于一个适当的范围。

目前，有关HDAC在植物生物胁迫应答反应中的功能研究得不多，而且相关研究也主要集中在草本植物[26-28]。HD2基因的表达水平似乎与抗病性负相关。例如，水稻中HD2类型的组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT701在水稻中的过量表达降低了组蛋白H4乙酰化水平，降低了转基因植株对稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)和水稻白叶枯病(Xanthomonasoryzaepvoryzae)的抗性，而敲除OsHDT701则提高了植株对病原菌的抗性，提高了模式识别受体(PRR)所在位点组蛋白H4乙酰化水平，以及PRR基因和抗病相关基因的表达水平[29]。最近的研究发现，小麦HD2类型的组蛋白去乙酰化酶基因TaHDT701是小麦白粉病(Blumeriagraminisfsp. tritici)抗性的负调控因子。TaHDT701与WD40-重复蛋白TakeHOS15共同作用招募TaHDA6到抗病相关基因TaPR1、TaPR2、TaPR5和TaWRKY45的启动子区，进而抑制这些基因的表达。敲除TaHDT701、TaHDA6和TakeHOS15基因提高了小麦对白粉病的抗性[30]。本研究发现，PtHDT902基因在84K杨中的过量表达降低了转基因植株对链格孢菌的抗病性，并降低其体内病程相关基因和JA合成基因的表达。本研究也表明，HD2基因的表达水平和抗病性负相关。HD2在植物生物胁迫应答反应中的作用机制仍有待进一步研究。