EEF1D基因表达对绵羊羊毛纤维直径和毛囊发育的影响

张 敏，杨 华，魏巧兰，何高明，沈 敏*

(1．石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832000;2．新疆农垦科学院，新疆 石河子 832000)

羊毛是纺织业重要的原料，羊毛品质决定着羊毛的价格和纺纱性能。其中羊毛的纤维直径是决定羊毛品质的关键因素。毛囊是羊毛生长发育的基础，研究毛囊发育对羊毛品质形成的遗传学机理具有重要意义。研究表明，羊毛纤维直径的大小受毛囊发育的影响[1]。毛干在皮肤经历周期性生长和脱落，而底部毛囊也经历包括生长期、退行期、休止期3个时期周期性循环。其中，生长期是毛干发生的时间，在此期间毛乳头细胞增殖，毛球膨大，毛母质细胞分化，毛囊向下生长至真皮层。毛囊生长期决定了羊毛的长度和细度，是研究毛囊发育信号分子调控的关键阶段。退行期的毛乳头毛球部萎缩，导致毛发逐步停止生长。而休止期毛囊上皮细胞变少，毛发脱落。随后在基因调控下再一次进入生长期。毛囊周期发育受多种信号通路和相关基因调控，影响毛囊发育的通路包括WNT通路、EDAR通路、BMP通路、FGF通路和SHH通路[1-5]，毛囊发育相关基因包括Wnt10b[6]、Edar[7]、BMP4[8]、FGF5[9]、PTCH1[10]等基因。其中，FGF5是FGF信号通路中已知的最有效的促进毛囊从生长期到休止期转换的因子，对毛囊发育调控至关重要[9]。Higgins等研究证实，FGF5能够诱导人毛囊的退行期，是决定人毛囊生长期比例和毛发生长的关键调节因子[11]。He等[12]通过在体外培养的绒山羊真皮乳头细胞中过表达FGF5，发现FGF5能够显著下调维持毛囊生长重要因子IGF-1、versican和noggin的表达。另外，Yoshizawa等[13]研究证实，FGF5基因突变可导致叙利亚仓鼠中毛发长度变长，这证明了FGF5可以调控毛囊发育。EEF1D是翻译延伸因子复合物的亚基，在细胞中负责蛋白质翻译的过程。于常江等[14]研究发现，在绵羊皮肤成纤维细胞中过表达EEF1D基因可显著上调FGF5的表达。由此可见，EEF1D基因参与毛囊发育调控。然而， 目前针对EEF1D基因表达与羊毛品质以及毛囊发育的研究较少。因此，本研究以中国美利奴羊和多胎萨福克羊为研究对象，分析EEF1D基因的组织表达差异，以及在品种间和毛囊发育周期的表达变化，为深入研究EEF1D基因在毛囊周期和羊毛品质形成中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验羊选自新疆农垦科学院种羊场中同一饲养条件下2～3岁健康成年羊，包括3只中国美利奴羊(新疆军垦型)和3只多胎萨福克羊。参照程晓印[15]毛囊发育周期时间，采集处于毛囊生长期(10月)、退行期(1月)和休止期(4月)绵羊体侧部皮肤组织和羊毛样品，以及中国美利奴羊(新疆军垦型)的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤、肌肉、脂肪、大脑和小脑组织。羊毛样品标记后用于细度测定，组织样品立即置于液氮中，转至-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

1.3 方法

1.3.1 羊毛纤维直径测定 羊毛样品洗净后，使用哈氏切片器(Y172型)制备羊毛纤维横截面试样切片，按照GB/T 10685-1989国家标准羊毛纤维直径试验方法，采用中国纺织科学研究院北京和众视野科技有限公司的CU-4纤维细度仪对羊毛切片进行纤维直径测定，每只羊取400根羊毛进行测定。

1.3.2 引物设计及合成 设计EEF1D基因(GenBank登录号：XM_015097560.1)和GAPDH基因(GenBank登录号：XM_001289746.1)的实时荧光定量PCR引物[14]，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。引物信息如表1所示。

表1 EEF1D和 GAPDH基因实时荧光定量引物信息

1.3.3 组织总RNA提取和cDNA合成 按照Trizol试剂使用说明书提取组织总RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明进行cDNA第一链的合成。20 μL体系和程序如下：5×gDNA Eraser Buffer(2.0 μL)，gDNA Eraser(1.0 μL)，Total RNA(2.0 μL)，RNase Free ddH2O(5.0 μL)在42 ℃孵育2 min，随后添加PrimeScript RT Enzyme Mix I(1.0 μL)、RT prime Mix(1.0 μL)、5×gDNA Eraser Buffer 2(for Real Time)(4.0 μL)、RNA Free ddH2O(4.0 μL)至PCR管中，37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA 保存于-20 ℃备用。

1.3.4EEF1D和GAPDH基因的PCR扩增EEF1D基因和GAPDH基因的PCR扩增体系均为20 μL，包括2×MasterMix(10 μL)，上、下游引物(各0.5 μL)，cDNA(1 μL)，ddH2O(8 μL)。

qRT-PCR扩增反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45个循环；95 ℃ 5 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；40 ℃ 30 s。扩增完成后，进行熔解曲线分析，分别读取EEF1D和GAPDH基因的CT值。

1.4 数据分析

采用2-ΔΔCt法计算EEF1D基因表达，应用IBM SPSS Statistics 22.0软件的ANOVA模块分析各组羊毛纤维直径、基因表达水平的差异。比较在不同组织和品种间以及羊毛不同发育时期的EEF1D基因表达差异，并进行显著性检验。

2 结果和分析

2.1 品种间羊毛纤维直径分析

统计分析在毛囊生长期、退行期和休止期中国美利奴羊和多胎萨福克羊的羊毛纤维直径和离散系数，结果如表2所示。在品种间，中国美利奴羊羊毛纤维直径极显著低于多胎萨福克羊(P<0.01)。

表2 多胎萨福克羊和中国美利奴羊的羊毛纤维直径的比较

2.2 总RNA提取

经1%琼脂糖凝胶电泳检测，绵羊10个组织的总RNA均存在28 s、18 s 和5 s 这3个条带，且条带清晰，无明显拖尾现象。核酸蛋白测定仪检测OD260/280值均介于1.8～2.0之间。

2.3 EEF1D和GAPDH基因的PCR扩增

将逆转录合成的cDNA各取1 μL模板进行EEF1D基因和GAPDH基因PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图条带与设计目的条带大小基本一致。结果如图1所示。

图1 EEF1D(A)和GAPDH(B)基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.4 EEF1D基因的组织表达分析

由图2可见，EEF1D基因在中国美利奴羊(新疆军垦型)10种组织中均有表达。其中，EEF1D基因在皮肤组织中表达量最高(P<0.05)。

图2 EEF1D基因的组织表达图

2.5 EEF1D基因在绵羊品种间和毛囊发育周期中的表达水平分析

由图3可知，中国美利奴羊(新疆军垦型)和多胎萨福克羊两个品种绵羊皮肤组织中EEF1D基因在毛囊发育期表达趋势一致，在休止期表达量最高，在退行期表达量最低(P<0.05)。在毛囊生长期和退行期，中国美利奴羊皮肤组织中EEF1D基因表达量显著和极显著高于多胎萨福克羊(P<0.05和P<0.01)。而在休止期，EEF1D基因的表达量在品种间差异不显著。

图3 EEF1D基因在绵羊毛囊发育期和品种间的表达变化

3 讨 论

我国是世界上最大的绵羊生产国，也是世界第三大羊毛生产国。但2020年1月-2020年10月，我国羊毛、毛条进口量累计为18.32×104t，羊绒进口量累计为0.59×104t[16]。羊毛市场的供需不平衡，优质细羊毛很大程度依赖进口，需要进一步提升国内毛用羊的羊毛品质。细度、长度、弯曲、吸湿性和回潮率等均是影响羊毛品质的重要因素，其中羊毛细度的经济价值相当于其他因素价值的总和。在羊毛市场上，超细毛价格是普通羊毛2～3倍。因此，优质细羊毛是市场关注的重点[17]，也是科研突破的焦点。研究细毛羊的羊毛品质形成的遗传学机理，对提升羊毛品质、推动优质细毛羊的育种进程有重要意义。

中国美利奴羊是在我国新疆育成的重要细毛羊品种，具有优秀毛品质的种质特性。多胎萨福克羊也是在我国新疆育成的多胎肉用羊新品系，以高繁殖力为主、兼具肉用性能好的种质特性。本试验中，中国美利奴羊平均羊毛纤维直径为16.41 μm，而多胎萨福克平均羊毛纤维直径为29.2 μm，中国美利奴羊的毛纤维直径显著低于多胎萨福克羊。该研究结果与王晶晶等[18]结果一致，进一步说明中国美利奴羊具有优良的羊毛品质。

EEF1D基因在真核生物蛋白质合成中负责翻译延伸过程，发挥交换因子的作用[24]。在细胞水平，EEF1D基因参与细胞周期活动[20]、卵母细胞成熟、大脑和睾丸转录激活、调节细胞应激反应[21]，以及EF-1βγδ蛋白质的合成[22]。在个体水平，EEF1D不但与各种癌症、神经元的发育[23]、胶质瘤[24]有关，且与乳腺发育和乳脂合成[25]有关。然而，在绵羊毛囊发育研究方面，EEF1D基因的组织表达以及影响毛囊发育和羊毛品质的研究报道非常少。于常江[14]采集18-30月龄美利奴羊的7个组织样本，经qRT-PCR分析EEF1D基因的组织表达差异，EEF1D基因的表达量从高到低分别：肺脏﹥脾脏﹥皮肤﹥肾脏﹥肝脏﹥心脏﹥肌肉。本试验中，EEF1D基因在中国美利奴母羊的10个组织中的表达量从高到低依次为：皮肤﹥脂肪﹥脾脏﹥肝脏﹥肾脏﹥小脑﹥肌肉﹥心脏﹥肺脏﹥大脑，与于常江试验结果明显不同。本试验EEF1D基因在皮肤组织中表达量最高，说明该基因在毛囊发育中起重要作用。

绵羊的毛囊包括初级毛囊和次级毛囊，初级毛囊在胎儿 65 d开始发育，次级毛囊在胎儿期85 d开始发育，次级毛囊的发育决定羊毛细度和品质[26]。绵羊毛囊发育具有周期性，包括生长期、退行期和休止期。本试验发现，毛囊生长期和退行期的中国美利奴羊EEF1D基因表达量显著高于多胎萨福克羊，即EEF1D基因在粗毛羊皮肤组织中表达量低，在细毛羊皮肤组织中表达量高，说明EEF1D基因的表达与羊毛细度相关。EEF1D基因表达量，在毛囊发育3个时期差异显著，且休止期最高，说明EEF1D基因参与毛囊发育，随着EEF1D基因表达量升高，使毛囊进入休止期。

4 结 论

EEF1D基因在皮肤组织中呈高丰度表达。在毛囊生长期和退行期，EEF1D基因在细毛羊中的表达量显著高于粗毛羊。EEF1D基因的高表达诱导毛囊发育进入休止期。