miRNA在股骨头坏死修复过程中的作用研究进展

潘海达，曾平

1 永嘉县中医医院伤骨科，浙江永嘉 325100；2 广西中医药大学第一附属医院仙葫院区骨科

股骨头坏死（ONFH）是指各种原因造成股骨头局部血流动力学改变导致的髋关节疾病，具有病程缠绵、难以修复的特点。其早期症状不明显，发病隐秘，大多数患者就诊时股骨头软骨面已出现塌陷，即不同程度的微骨折。ONFH 进展不可逆，如不积极治疗，将很快发展至骨关节炎阶段。ONFH 的预后取决于缺血再灌注、新生股骨对死骨的爬行替代程度［1］。在ONFH 修复过程中，会经历骨质坏死变性、坏死骨质吸收肉芽组织长入、血管组织钙化修复三个阶段，包含破骨细胞增殖坏死骨质吸收、修复带内血管内皮细胞生长活跃及成骨细胞骨爬行替代过程［2］。miRNA 是一类小的非编码RNA，具有转录后调控基因表达的功能。miRNA 表达具有高度的组织特异性，并在关键的生理过程中受到动态调控［3］。研究表明，miRNA 几乎参与了所有生物过程，包括细胞增殖、分化、衰老、凋亡、肿瘤形成和应激反应［4］。现就miRNA 在ONFH 病理修复过程中作用的研究进展综述如下。

1 miRNA参与ONFH修复过程中的血管生成

ONFH 在磁共振成像T2加权成像中具有典型的“双线征”，其中高信号区即血管长入及肉芽组织爬行替代区域。血管长入涉及细胞增殖、迁移、分化、管形成，并受到血管生成因子的调控，miRNA参与了ONFH坏死修复过程中血管的生成及爬行替代。

血管生成受多种生长因子的调节，例如血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮钙黏蛋白。研究显示，在小鼠静脉内皮细胞中，miR-10a 过表达可导致VEGF 和血管内皮钙黏蛋白表达水平降低；而转染miR-10a抑制剂后，细胞中VEGF 和血管内皮钙黏蛋白表达水平恢复正常。miR-92a 作为血管生成的负向调节剂，在人类内皮细胞中高表达，其表达量与年龄呈负相关。MURATA 等［4］比较了4 例大转子骨折患者和4 例健康对照者的血浆miRNA 浓度，发现骨折患者发病24 h 后miR-92a 表达水平开始降低，而发病后21 d 恢复正常；为了确定miR-92a 在骨折愈合中的作用，该研究对股骨骨折小鼠静脉注射miR-92a 拮抗剂LNA 稳定寡核苷酸，结果显示拮抗剂组较对照组骨痂形成、重塑良好，其血管数量、血管面积较对照组分别高出74%、200%。这表明抑制miR-92a表达可以促进血管新生，促进ONFH局部微骨折的修复和坏死组织的爬行替代。

与miR-92a 相反，miR-126 是体内血管生成信号传导的正向调节剂。miR-126 可通过直接抑制多个靶标来增强血管内皮细胞对VEGF 的反应，包括Sprouty 相关的EVH1 结构域含蛋白1、磷酸肌醇3 激酶调节亚基2、血管细胞黏附分子1［5］，从而促进血管生成及维持血管内皮细胞的完整性。

缺氧与血管新生密不可分，缺氧诱导因子1（HIF-1）与VEGF 协同作用，在低氧低灌注条件下刺激血管新生，改善局部缺血。研究显示，miR-18a、miR-20a、miR-20b等均参与了细胞内HIF的调控，影响血管生成［6］。同时，血管的生成与爬行替代对局部组织修复、坏死吸收具有滋养作用，特别是在承重区，即股骨头中内、侧柱，坏死区血供对于“带塌陷”生存、血供丰富与否起到关键性作用。

2 miRNA参与ONFH修复过程中的骨代谢

2.1 miRNA与破骨细胞 ONFH患者股骨头X线下“新月征”的出现，提示局部股骨头存在病理性微骨折，其过程包含空骨陷窝的增多、破骨细胞的增殖及骨质的吸收和破坏。在ONFH发病过程中，破骨细胞对骨质的破坏与吸收对于疾病进程和预后尤为重要。

c-Fos 与破骨细胞功能调节密切相关，c-Fos 作为破骨细胞的“感受器”被核因子κB 受体激活因子（RANK）配体激活后，可以诱导破骨细胞分化［7］。c-Fos 的触发激活过程需要miR-21 参与，同时miR-21还可以上调程序性细胞死亡4蛋白（PDCD4）表达水平，并激活c-Fos，从而激活破骨细胞。实验发现，敲除miR-21的小鼠PDCD4蛋白表达水平受到抑制，提示破骨细胞的激活及活性与miR-21相关［8］。

与miR-21 具有相反作用的有miR-503 和miR-148a。RANK 是一种表达在破骨细胞前体上的Ⅰ型膜蛋白，miR-503的种子区与RANK mRNA的氨基酸编码序列可互补结合。在卵巢切除小鼠中，抑制miR-503 表达可导致破骨细胞活性增强从而骨吸收增加；体外实验表明，向人外周血单个核细胞培养基中分别转染pre-miR-503、antago-miR-503 后用于培养破骨细胞，前者培养的破骨细胞活性降低，而后者培养的破骨细胞活性增强［9］。在一项微阵列测定中发现，has-miR-148a、has-miR-483、has-miR-223、hasmiR-21、has-miR-214 被上调，而has-miR-155、hasmiR-125a、has-miR-27b、has-miR-145 被下调；实时荧光定量PCR 结果与miRNA 微阵列结果一致，其中miR-148a 在破骨细胞分化中显著上调；体外实验表明，miR-148a可通过抑制NFATc1和肌肉—神经纤维肉瘤癌基因同源物B从而抑制破骨细胞活性［10］。

miRNA通过介导破骨分化及活性，影响死骨的吸收及骨质的破坏，对于坏死骨组织吸收、塌陷的进展与否，具有决定性意义。如何通过miRNA抑制破骨细胞活性，从而延缓甚至阻滞塌陷的进展，保持股骨头球形结构完整，对于ONFH的治疗具有重要意义。

2.2 miRNA 与成骨细胞 在ONFH 坏死修复过程中，“硬化带”的出现一定程度上是成骨细胞主导的骨修复在影像学上的表现。ONFH的预后与其修复方式是“成骨性修复”还是“破骨性修复”相关［11］。因此，成骨细胞的活性对于ONFH的修复具有重要意义。

研究发现，miR-214 在体内和体外均对成骨细胞的增殖分化具有抑制作用［11］。已知转录激活因子4C（ATF4）对成骨细胞分化和功能具有关键作用，miR-214可直接与ATF4的3'-UTR位点结合，从而表现出对成骨细胞活性的抑制作用［12］。

骨形态发生蛋白（BMP）在成骨细胞生长、分化、凋亡等过程中发挥重要作用［13］。小鼠成骨细胞转染miR-542-3p 后可抑制BMP 表达，导致成骨细胞凋亡增加及增殖减少；对成骨细胞给予miR-542-3p 干预后，细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）含量增加，Caspase-3作为成骨细胞凋亡因子，会导致成骨细胞凋亡；同样干预BMP 形成的还有miR-133 和miR-135，过表达miR-133或miR-135会抑制碱性磷酸酶、骨钙素和同源框A10生成，进而抑制成骨分化［14］。骨胶原蛋白代谢异常可导致ONFH、骨关节炎在内的各种骨病发生。对于成骨细胞系，miR-29b虽然不会抑制未成熟成骨细胞中的胶原蛋白表达，但会导致分化后期胶原mRNA水平下降［15］。这可能是由于miR-29b选择性剪接不同的胶原3′-UTR位点所致［16］。

骨稳态对ONFH 的转归、进展具有重要作用，成骨细胞与破骨细胞处于竞争状态。在治疗ONFH时，如何在抑制破骨细胞活性的同时促进成骨细胞增殖，miRNA提供了一个新的角度。

3 miRNA 参与ONFH 修复过程中的间充质干细胞分化

间充质基质细胞（MSCs）在组织工程和再生医学中具有广阔的应用前景。MSCs 能够分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和肌细胞，其中成脂分化与骨分化存在相互抑制关系。脂肪代谢紊乱是ONFH的重要病因之一［2］，因此在ONFH 的治疗中，MSCs的分化至关重要。

MSCs在分化过程中受多种信号通路交互影响，其中包含RUNX 家族转录因子2（Runx2）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）。miR-204可以通过抑制Runx2，从而抑制MSCs 的成骨分化，同时增强MSCs 的成脂分化。与其类似作用的还有miR-637，不同的是miR-637 作为成骨转录因子抗体发挥作用［17］。研究显示，对MSCs 给予糖皮质激素干预后，miR-708 含量明显增高，且成脂分化活跃、成骨抑制［18］。另有研究发现，miR-708 与母亲DPP 同源物3（SMAD3）3′-UTR 位点相结合后，激活的SMAD3 可以干扰CCAAT转录因子与Runx2启动子内的负调控元件结合，从而介导MSCs成脂或成骨分化趋势［19］。

PPARγ 是脂肪形成的重要调控因子，其在脂肪细胞形成中具有不可替代的作用，经激活的PPARγ不仅能够抑制成骨分化，还能明显增加MSCs 的成脂分化［20］。miR-27b 可以抑制PPARγ 和CCAAT 转录因子这两种关键的成脂转录因子，从而抑制MSCs成脂分化。同样，miR-21 也可以通过抑制Smad3 磷酸化从而抑制MSCs成脂分化［21］。

此外，Wnt/β-Catenin 信号通路在调控MSCs 分化中起到重要作用。糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、连环蛋白拮抗因子同源物1 作为miR-8485 的靶点，当miR-8485 在体内高表达时，其可激活连环蛋白拮抗因子同源物1、GSK-3β，从而激活Wnt/β-Catenin信号通路，进而促使MSCs向软骨分化。

4 miRNA参与ONFH修复过程中的炎症反应

研究显示，ONFH 患者血清中的淋巴细胞数量与病情严重程度呈负相关［22］。减少的淋巴细胞可以产生TGF-β、IL-4、IL-10 等炎症因子，而局部无菌性炎 症 也 是ONFH 的 病 理 表 现［2］。miRNA 参 与 了ONFH修复过程中的炎症反应。

TGF-β 可通过刺激PLCγ/PKCα 磷酸化，增强血红素加氧酶1（HO-1）等多种炎症因子表达；miR-744可与TGF-β 近端的3'-UTR 位点结合，从而减少局部炎症反应；转染miR-744 的人肾皮质近曲小管上皮细胞培养上清中，TGF-β含量明显减少［23］。miR-519b则能干扰HO-1转录，随着miR-519b表达降低，HO-1表达增强，表明miR-519b 可以通过TGF-β 直接参与ONFH局部炎症反应［24］。

磷脂酶和张力蛋白同源物（PTEN）是T淋巴细胞活化的负调节剂，同时又是miR-181a 的作用靶点。miR-181a 抑制PTEN 可激活PI3K 信号通路和活化T淋巴细胞核因子5表达［25］。高表达的miR-181a激活PI3K 通路，并刺激T 淋巴细胞增殖、分化等生物过程；miR-181a还可以调节细胞对外界刺激的敏感性，改变T淋巴细胞的信号阈值，进而影响T淋巴细胞活性［26］。在ONFH 的病理过程中，无菌性炎症反复刺激，导致局部微循环障碍，是ONFH局部持续肿胀、疼痛的重要原因之一。目前研究显示，miNRA 与ONFH的发生、发展、预后相关，但将miRNA 作为ONFH的诊断甚至治疗手段还需要进一步探索。

miRNA 是影响病理生理、疾病转归的重要生物因子。miRNA参与了ONFH血管生成、成骨细胞、破骨细胞、MSCs 修复过程、局部炎症反应等生理病理过程，对ONFH 的发生、发展、诊断、治疗、预后具有重要意义。目前关于miRNA 参与ONFH 修复的具体过程、机制尚处于探索阶段，随着分子生物学的发展，miRNA参与ONFH生物学的过程将逐渐明了，从而为ONFH的临床诊疗提供新的思路。