Toll样受体在骨退行性疾病发生发展中作用机制的研究进展

黎祥涛，苏天，温鹏，崔红旺

海南医学院第一附属医院创伤医学中心，海口 570102

骨退行性疾病是以一类以骨质疏松、关节软骨退变及周围软组织慢性炎症为主要特征的全身性疾病，包括椎间盘退行性变、骨关节炎和骨质疏松。随着我国人口老龄化的进展，骨退行性病变发病率逐年上升，给家庭和社会带来沉重负担。由于其发病机制尚不完全清楚，治疗上多以止痛、理疗等对症治疗为主，治疗效果欠佳。研究发现，固有免疫在骨退行性疾病发展中发挥关键作用。Toll样受体（TLRs）作为固有免疫模式识别受体中的典型代表，广泛参与病原相关分子模式（PAMPs）的识别及内源性危险信号相关分子模式（DAMPs）的感知，进而启动固有免疫应答［1］。TLRs 大量表达于骨细胞、破骨细胞、成骨细胞表面，参与骨退行性疾病发展［2］。TLRs 传导信号根据衔接蛋白不同可分为MyD88 依赖性和TRIF 依赖性两种途径，核因子κB（NF-κB）在这两种途径中均发挥关键性作用，其表达释放出高水平的炎症细胞因子IL-1、TNF-α、IL-6，可增加成骨细胞凋亡，同时通过B 细胞产生的NF-κB 配体受体激活剂（RANKL）间接刺激破骨细胞生成［3］。在骨组织及周围软组织损伤区域中，可检测到TLRs、NF-κB 及炎症介质表达明显升高，并且TLRs介导的信号通路释放炎症介质及蛋白水解酶，调控骨细胞凋亡及周围组织损伤过程［4］。这提示骨退行性疾病的进展可能与TLRs/NF-κB 信号通路介导的固有免疫反应有关。现将TLRs 在骨退行性疾病中的作用机制研究进展综述如下。

1 TLRs在椎间盘退行性变发生发展中的作用机制

椎间盘退行性变是由于中央髓核和细胞外基质的蛋白聚糖分解代谢，导致椎间盘的水含量和可压缩性降低，纤维环发生微裂和撕裂，椎间盘结构完整性受到破坏。椎间盘退行性变的病理特征是分解代谢和炎症刺激过程，椎间盘分解代谢状态是由椎间盘细胞产生炎症级联反应驱动的。TLRs 和炎症介质在变性的椎间盘组织中呈高表达状态，TLRs激活与椎间盘退行性变进展密切相关［5］。

既往研究显示，椎间盘感染低毒性厌氧菌（如痤疮杆菌）是椎间盘退变的原因之一。痤疮杆菌能够在人体及动物椎间盘环境中存活，并通过激活TLRs途径诱导退行性变。体外研究显示，加入两种痤疮衣原体菌株刺激椎间盘细胞后，细胞中IL-1β、IL-6、IL-8 和诱导型一氧化氮合酶mRNA 表达均显著升高；加入TLR2/4 拮抗剂后，细胞中IL-6 mRNA 表达降低［6］。

最新研究认为，椎间盘的过度机械负荷会改变基质特性并影响椎间盘细胞代谢，从而导致退行性椎间盘疾病和椎间盘源性疼痛的发展，体外椎间盘细胞的高机械应变培养可使椎间盘细胞中TLR2、TLR4、TNFα mRNA 表达上调［7］。已有研究表明，TLR4参与中央髓核的炎症反应，在发生椎间盘变性时其水平上调。中央髓核细胞中TLR4 的活化导致细胞生物物理性质的显著、持久的变化，包括水力渗透性和渗透活性水含量，以及肌动蛋白细胞骨架的改 变。JACOBSEN 等［8］使 用TLR4 激 动 剂 脂 多 糖（LPS）培养从牛椎间盘中分离的中央髓核细胞，发现细胞内一氧化氮（NO）释放增加，IL-6 mRNA 表达上调；细胞水力渗透性和细胞半径增加，导致细胞抗压刚度降低；利用TLR4 抑制剂TAK-242 处理细胞能减轻LPS 诱导的皮质肌动蛋白重塑和IL-6 上调，保护中央髓核细胞的机械生物学功能。但是也有研究认为，TLRs 对保持椎间盘的稳态是必须的，TLR2/丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路对于髓核细胞的细菌吞噬作用和吞噬酶体的形成至关重要［9］。

在所有细胞中，TLRs 信号通路激活的主要结果都是促炎细胞因子的产生。TLRs信号通路激活后，促炎细胞因子和蛋白水解酶的释放可直接导致椎间盘退变。LI 等［10］报道，椎间盘退变患者手术切除的椎间盘组织中存在TLRs mRNA 表达，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR6 mRNA的表达量与椎间盘退变程度相关。WANG 等［11］报道，以IL-1β 或TNF-α 培养椎间盘细胞均可增加TLR1、TLR2、TLR4 mRNA 表达，并造成细胞衰老和凋亡增加；细胞凋亡率与IL-1β、TNF-α 浓度和持续时间呈正相关。由此可见，椎间盘细胞分泌的炎症因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 与椎间盘退行性变的进展直接相关，具有促进趋化因子产生、激活TLRs和分解代谢酶分泌的协同效应。

在椎间盘退行性变过程中，基质降解的蛋白酶活性至关重要。TLRs 激活导致椎间盘组织中的基质金属蛋白酶（MMPs）及聚蛋白多糖酶（ADAMTS）表达增加，MMPs 和ADAMTS 具有分解细胞外基质中软骨组织构成分子的能力，如纤维连接蛋白、肽聚糖、Ⅰ型和Ⅱ型胶原等。除了上调基质降解酶外，TLRs信号通路激活还可以抑制细胞外基质合成，从而进一步加剧分解代谢［12］。GLAESER 等［13］报道，对终板软骨细胞采用IL-1β 预刺激并进行机械负载，NF-κB mRNA 表达明显升高，下游MMP-3、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表达增加；加入NF-κB 抑制剂NEMO 寡肽与终板软骨细胞共培养能够增加细胞活力，并降低IL-1β 预刺激、机械负载细胞中的MMP-3 mRNA 表达水平。TLRs 是众多理化及生物因素作用于中央髓核和细胞外基质的靶点，TLRs信号通路激活可导致异常的炎症因子及蛋白酶的释放引起组织破裂。因此，阻断TLRs/NF-κB 信号通路可能为椎间盘降解提供一种潜在的降级治疗方法。

2 TLRs在骨关节炎发生发展中的作用机制

骨关节炎是以软骨和软骨下骨变性以及滑膜炎相关为主要病理变化的慢性退行性骨关节病。固有免疫受体识别体内外危险因素后触发软骨和滑膜细胞的慢性炎症反应，与骨关节炎的进展有直接关系，无菌性炎症可由软骨细胞释放并激活模式识别受体的损伤相关分子模式引起［14］。TLR2和TLR4作为固有免疫识别受体TLRs家族代表，在骨关节炎发展中具有重要作用。

研究显示，骨关节炎患者关节软骨及滑膜组织中TLR2 和TLR4 mRNA 表达较正常组织明显上调；并且在骨关节炎患者滑膜关节液和组织中含有能够激活TLRs 的几种DAMPs，包括肽聚糖、脱蛋白、S100/钙粒蛋白家族和透明质酸等［15］。YOU 等［16］对原代培养的软骨细胞加入透明质酸后，TLR4、MyD88、TRAF-6 mRNA 表达明显增加，下游诱导的炎症细胞因子及MMPs 表达升高，表明TLRs 被透明质酸识别后可激活信号通路，引起慢性炎症和基质金属蛋白酶释放，引发关节软骨的分解反应。大多数DAMPs 是由骨关节内外因素损伤所产生的软骨或滑膜衍生物，也有一些来自于软骨细胞衰老崩解释放的内源性物质，如dsRNA、高迁移率族蛋白1（HMGB-1）、尿调素等。LI 等［17］向大鼠关节腔内注射HMGB-1 构建关节炎模型，发现HMGB-1 可激活TLR4/NF-κB 信号通路，导致软骨组织中MMP-13、ADAMTS5、IL-1β、IL-6 mRNA表达上调，引起关节软骨破坏、软骨下骨变性和滑膜炎；而对TLR4 和Myd88 基因敲除大鼠进行同样的试验，发现软骨组织中MMP-13、ADAMTS5、IL-1β、IL-6 mRNA 表达受到明显抑制。

研究发现，骨关节炎患者软骨组织中TLR7 mRNA 表达显著高于健康受试者；向软骨细胞中加入TLR4 激活剂LPS 共培养后，TLR7 mRNA 表达显著提高，MMP-3、MMP-13 表达上调，半胱天冬酶3 和Bax 凋亡蛋白表达增加，促进软骨细胞凋亡和基质降解；加入TLR7 抑制剂siRNA 转染软骨细胞后，LPS 刺激软骨细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表达显著下降，缓解LPS 诱导的细胞凋亡和ECM 降解［18］。此外，STOLBERG 等［19］对人类和小鼠软骨组织进行RT-PCR 检测发现，TLR3、TLR9 也在软骨组织中表达；通过小鼠关节腔内注射环孢素G 构建骨关节炎模型发现，与野生型小鼠相比TLR3 和TLR9敲除显著降低了小鼠软骨细胞凋亡和软骨基质降解，减少滑膜中IL-1β、TNF-α 炎症浸润，减缓了骨关节炎的进展长达8周。

脂多糖结合蛋白LBP和CD14是TLRs的辅助分子，对于低度炎症引起的创伤后骨关节炎软骨破坏是必需的。动物实验显示，向小鼠关节腔内注射TLR2/4 激活剂LPS 后，与野生型小鼠相比，LBP 和CD14 基因敲除小鼠软骨中IL-1β、IL-6 和ADAMTS5 mRNA 表达受到抑制，有效缓解了软骨破坏和滑膜炎［20］。可见，TLRs介导的信号通路参与骨关节炎软骨凋亡和滑膜变性的过程，对组织修复和关节结构破坏具有重要作用。因此，以TLRs及其介导的信号通路上作用元件、辅助因子、下游炎症介质等为靶点进行干预，最终达到骨关节炎的缓解甚至治愈，成为骨关节炎预防及治疗的新趋势。

3 TLRs在骨质疏松症发生发展中的作用机制

骨质疏松症的特征是骨密度低，骨小梁微结构退变，骨脆性增强和骨折易感性增加，尤其在绝经后妇女中更常见。雌激素缺乏是绝经后骨质疏松发生的直接原因，当雌激素不足时，骨合成代谢和抗破骨作用减少，导致持续的骨破坏引起骨质疏松。此外，绝经后妇女免疫状态的改变也间接导致骨破坏［21］。崔红旺等［22］报道，绝经前健康妇女接受卵巢切除术8周后TNF-α 表达明显增加，其表达水平与骨吸收指标BV/TV、Tb. Th、Tb. N、Tb. Sp 和骨密度呈正相关。MARAHLEH 等［23］报道，将TNF-α与小鼠原代颅骨细胞共培养后，细胞中的RANKL mRNA 表达显著提高，但OPG mRNA表达无明显变化，表明TNF-α可间接增高RANKL/OPG 比例，支持破骨细胞前体存活和分化。在破骨细胞前体细胞中加入TNF-α 后，TRAP阳性细胞数显著增加；而在TNF受体Ⅰ和Ⅱ缺陷的破骨细胞前体细胞共培养物中加入TNF-α 后，未检出TRAP 阳性细胞。这提示TNF-α 可直接激活破骨细胞前体细胞表面TNF 受体，促进破骨前体细胞分化。由此可见，免疫系统激活导致炎症因子表达上调能够促进破骨前体细胞分化，加重骨质疏松。

TLRs 的表达模式在破骨细胞的不同阶段各有不同，破骨细胞前体细胞表达TLR1～9，在向成熟破骨细胞分化的过程中主要表达TLR2 和TLR4，提示TLR2 和TLR4 在破骨细胞分化过程中起主要作用。来自造血干细胞的破骨细胞表达TLRs 并对DAMPs有反应，DAMPs 刺激后会引起破骨细胞前体细胞活化，从而促进破骨细胞前体细胞向破骨细胞转化，促进骨质疏松症的进展［24］。动物实验显示，在糖尿病骨质疏松小鼠中，敲除TLR4 基因可降低TRAP 阳性细胞细胞率和TNF-α mRNA 表达水平，改善骨小梁碎裂程度，认为TLR4 基因敲除可通过抑制TLR4 激活和TNF-α 释放来减轻骨质疏松［25］。因此，调节或抑制TLR4 可作为治疗骨质疏松症的新的研究方向。ALQRANEI 等［26］报道，在破骨前体细胞中加入TLR2/4激活剂LPS后，TRAP 阳性细胞显著增加；而在加入RANKL预培养与未加入RANKL的破骨前体细胞同时加入LPS 后，两者之间TRAP 阳性细胞率无显著差异，RANKL、OPG mRNA 表达水平无明显变化，表明TLR4 激活能独立于RANKL/RANKL/OPG 轴以外引发破骨细胞活化；在LPS 孵育的破骨前体细胞中加入TLR2/4 抑制剂TAK-242 能够显著降低TRAP 阳性细胞率，表明对TLR4 干预能抑制破骨前体细胞活化，延缓骨质疏松进展。

研究发现，TLRs 信号通路可将RANKL 信号通路中的下游分子隔离开来，从而抑制破骨细胞早期分化。在小鼠骨髓源性巨噬细胞和人外周血单核细胞中，同时加入RANKL 和TLRs 激活剂LPS 后，与较单纯RANKL 孵育相比TRAP 阳性细胞率显著降低，表明TLRs在破骨前体活化早期阶段有负面作用；而在破骨前体细胞中加入RANKL 预处理24 h 后再加入LPS 培养48h 后，与单纯RANKL 孵育72 h 相比，TRAP 阳性细胞率显著提高，表明尽管TLRs 在破骨细胞形成的早期阶段有负面作用，但在破骨前体细胞分化的后期阶段具有积极作用［27］。因此，靶向TLRs 诱导的破骨前体细胞活化可能是一种有效的抑制骨质疏松症等溶骨性疾病治疗策略。

TLRs 受体不仅表达在破骨细胞前体细胞表达，在成骨细胞膜表面也有大量表达。FISCHER 等［28］从小鼠颅骨分离出成骨细胞进行培养，加入LPS后，成骨细胞膜上的TLR2、TLR4 mRNA 表达上调，RANKL mRNA 在2 h 内显著上调，而OPG mRNA 水平相对较低，表明成骨细胞膜上TLR2/4 的激活能够上调RANKL mRNA 表达，促进破骨前体细胞活化，进而发生骨质疏松。此外，王瑞等［29］、张倩璐等［30］报道，在孵育的成骨细胞中加入LPS后，成骨分化基因ALP 和OCN 表达受到抑制，用siRNA 转染TLR4 后显著增加成骨分化基因水平和成骨细胞矿化能力。总之，TLRs可以通过增加破骨前体细胞活化和抑制成骨细胞活性导致骨质疏松，成骨细胞也可能通过干扰RANKL/RANK/OPG 轴，作用于未分化破骨细胞前体细胞加剧骨质疏松。因此，通过靶向调控TLRs 及下游信号不失为一种干预骨质疏松进展的方法。

综上所述，固有免疫系统异常激活释放炎症介质参与骨细胞凋亡和组织损伤过程，在椎间盘退行性变、骨关节炎、骨质疏松症的发病机制中发挥重要作用。当前以TLRs 作为固有免疫异常激活干预靶点的研究尚处于起步阶段，具体信号通路错综复杂，深入研究TLRs 在骨退行性疾病中的作用机制可以为骨退行性疾病的治疗提供新的靶点和策略。TLRs 激活导致溶骨性改变和基质蛋白水解机制是开发新型抗骨退行性病变药物的一种很有前途的治疗策略，但是目前还局限于离体细胞或动物试验，临床证据不足，还需要进行更多的临床试验。