气相色谱-质谱联用法测定液体调味料中4种氯丙醇的含量

刘沁颖，侯 靖，毛燕妮，卢跃鹏，周晓婷

（1.武汉食品化妆品检验所，湖北 武汉 430040；2.国家市场监管重点实验室（食用油质量与安全），湖北 武汉 430040）

氯丙醇类化合物是一种人们公认的在食品加工过程中产生的污染物，包括3-氯-1,2-丙二醇（3-chloro-1,2-propanediol，3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-chloro-1,3-propanediol，2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dichloro-2-propanol，1,3-DCP）和2,3-二氯-1-丙醇（2,3-dichloro-1-propanol，2,3-DCP），具有肾脏毒性、生殖毒性、免疫抑制和潜在致癌性[1-2]。1993年，世界卫生组织对氯丙醇类物质的毒性发出警告；2011年，国际癌症研究机构评估3-MCPD的毒性后将其归为2B类，认为它是一种对人类致癌性证据有限的可能致癌物。齐丽娟等[3]基于系统文献检索对3-MCPD及其酯类经口暴露的危害进行评估，动物研究显示3-MCPD毒性效应主要靶器官为肾和睾丸。动物长期低剂量暴露可引起雄性大鼠进行性肾毒性、睾丸毒性以及雌性大鼠肾毒性和乳腺增生，从而导致动物生育能力下降，表现出精子活性降低、产仔数量减少和完全不育等生殖毒性。小鼠短期高剂量暴露还可引起神经毒性作用。在最近的文献报道中，SEVIM Ç 等[4]通过大鼠脑组织中miR-21和PTEN-Akt等的表达情况，发现3-MCPD和缩水甘油亚可诱导大鼠脑组织凋亡。JIN C N等[5]采用3-MCPD灌胃大鼠28 d后，肾脏组织中发现有975个蛋白出现失调。生物信息学分析显示，3-MCPD可导致内源性代谢中与氨基酸、脂质和碳水化合物代谢相关的几种酶发生改变，参与这些通路的一些蛋白也发生了变化，这为肾毒性的分子机制提供了更全面的认识。LEE H S等[6]使用C2C12成肌细胞评估了3-MCPD的体外肌肉毒性，发现3-MCPD通过抑制mTOR和p70S6激酶表达从而对肌肉分化产生抑制作用。SCHULTRICH K等[7]研究发现，氧化应激可能在3-MCPD毒性中起作用，在肾脏、睾丸和大脑三个器官中，氧化应激的生物标志物不可逆氧化DJ-1蛋白的数量在喂食低剂量的3-MCPD时即显著增加。FAN Y等[8]研究发现，1,3-DCP作用于AKT/mTOR/FOXO1信号通路抑制自噬导致脂质积累，使实验小鼠表现出肝脏中甘油三酯、总胆固醇和脂滴数量增加。

液体调味料中氯丙醇的主要来源为水解植物蛋白，其为植物性蛋白质在酸催化作用下，水解后的产物，主要成分是氨基酸。由于植物性原料中有脂肪的存在，在使用过量盐酸水解时，甘油三酯也会水解为丙三醇，并与盐酸进一步反应产生各种氯丙醇。另外有报道[9]称纸制品生产过程中可能会添加增强抗湿性的环氧氯丙烷，当纸制品接触到液态食品时，其中的环氧氯丙烷可分解成氯丙醇，进而迁移到食品中造成污染。曾莹等[10]报道纸制品中1,3-DCP与3-MCPD迁移被普遍检出。因此，建立液体调味料中氯丙醇含量检测方法很有必要。

现有氯丙醇检测方法主要有气相色谱-质谱联用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）、毛细管电泳-电化学检测法[11]、高效液相色谱-荧光检测法[12]、近红外光谱法[13]、电化学传感器法[14]以及比色法[15]等，其中，使用最广泛的是气相色谱-质谱联用法。氯丙醇的提取分离多采用固相支持液液萃取技术，常用的载体有硅胶[16]、氧化铝[17-18]和硅藻土[19-21]。氯丙醇为极性化合物，为了提高检测灵敏度，需要进行衍生处理，常见的衍生剂有七氟丁酸酐[16-17，21]、七氟丁酰基咪唑[19]、六甲基二硅氮烷与三甲基硅基三氟甲烷磺酸盐[18]、环己酮[20]和苯硼酸[22-23]。近几年也有非衍生化检测氯丙醇的报道，但需要结合凝胶色谱[24]或高分辨质谱[25]，难以推广。本研究拟参考美国分析化学家协会（association of official analytical chemists，AOAC）方法，选取酱油、鱼露及水解植物蛋白液为液体调味料的代表，采用商品化硅藻土柱进行固相支持液液萃取，七氟丁酰基咪唑衍生，气相色谱-质谱联用检测，通过对前处理条件进行一系列优化，建立了一种前处理简单快捷的液体调味料中氯丙醇含量测定方法，为分析液体调味料及其他食品中的氯丙醇提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿造酱油、鱼露、水解植物蛋白液：购于武汉市场。

正己烷、乙酸乙酯（均为色谱纯）：德国Merck公司；氯化钠、无水硫酸钠（均为分析纯）：国药试剂化学有限公司；七氟丁酰基咪唑（色谱纯）：美国REGIS公司。

3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）、2,3-二氯-1-丙醇（2,3-DCP）、D5-3-氯-1,2-丙二醇（D5-3-MCPD）、D5-2-氯-1,3-丙二醇（D5-2-MCPD）、D5-1,3-二氯-2-丙醇（D5-1,3-DCP）和D5-2,3-二氯-1-丙醇（D5-2,3-DCP）标准物质（纯度均＞99%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪、DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；Vortex-Genie 2涡旋混匀器：美国Scientific Industries公司；N-EVAP111氮气浓缩仪：美国Organomation Associates Jnc.公司；大孔硅藻土柱（12 mL）：北京迪马科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试剂与标准溶液配制

配制20%氯化钠溶液、1 000 mg/L氯丙醇及氘代氯丙醇标准储备液、氯丙醇混合标准中间液（10 mg/L）及氘代氯丙醇混合标准工作液（10 mg/L）。

1.3.2 样品前处理

称取4 g液体样品于15 mL离心管中，对于不含食盐的试样，称样后加入1 g氯化钠，准确加入氘代氯丙醇混合标准工作液20 μL，超声混匀5 min，待净化。将液体全部转移至硅藻土小柱中，平衡10 min。以10 mL正己烷淋洗，弃去流出液，以15 mL乙酸乙酯洗脱氯丙醇，收集洗脱液于玻璃离心管中。在洗脱液中加入4 g无水硫酸钠，振摇，放置10 min后过滤，转移滤液至密闭性很好的透明具盖玻璃瓶中，氮吹浓缩至约0.5 mL（切忌浓缩至干），用2 mL正己烷溶解，涡旋混合。用气密针加入0.04 mL七氟丁酰基咪唑，立即拧紧瓶盖，涡旋混合30 s，于70 ℃反应20 min。取出冷却至室温，加入2 mL 20%氯化钠溶液，涡旋混合1 min，静置使水相和正己烷相分层，转移正己烷相，加入约0.3 g无水硫酸钠进行干燥后供气相色谱-质谱测定。系列标准工作液同步衍生化。

1.3.3 气相色谱-质谱分析条件

GC条件：DB-5MS毛细管柱（0.25 μm×0.25 μm，30 m）；载气为高纯氦气（He）（纯度≥99.999%）；流速为1 mL/min；进样口温度为250 ℃；不分流进样，进样量1 μL；升温程序为50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至90 ℃，再以40 ℃/min升至270 ℃，并保持5 min。

MS条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；溶剂延迟时间8 min；监测方式为选择离子监测（selected ion monitoring，SIM），各化合物定量及定性、定量离子信息见表1。

表1 各化合物定量及定性离子Table 1 Quantitative and qualitative ion of each compounds

续表

1.3.4 数据分析

采用Agilent MassHunter 11.0软件采集数据并分析，采用Microsoft Office Excel 2016对实验数据进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

氯丙醇的衍生物极性较小，一般使用弱极性色谱柱进行分离。因此，比较了5%苯基亚芳基聚合物毛细管色谱柱（DB-5MS）和5%苯基-甲基聚硅氧烷毛细管色谱柱（HP-5MS）对分离效果的影响。结果表明，同样升温条件下，使用HP-5MS色谱柱分离时，3-MCPD与2-MCPD无法完全分开，分离度为1.2；而使用DB-5MS色谱柱分离时，3-MCPD与2-MCPD可以基线分离，所以选择DB-5MS色谱柱进行实验。使用DB-5MS色谱柱对4种氯丙醇及其氘代内标物进行分离，总离子流色谱图见图1。

图1 4种氯丙醇及其氘代内标物GC-MS分析的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of 4 kinds of chloropropanols and their deuterated internal standards analyzed by GC-MS

2.2 淋洗溶液对结果的影响

正己烷淋洗可以除去提取液中的脂类等非极性干扰物，但是正己烷淋洗也可能会造成目标物的损失。分别称取4份液体样品4 g进行加标实验，分别用0、10 mL、20 mL和30 mL正己烷淋洗，检测淋洗液及后续15 mL乙酸乙酯洗脱液中氯丙醇含量。结果表明，不加正己烷淋洗不能有效除脂，后续实验过程中易出现乳化现象；1,3-DCP与2,3-DCP易被正己烷洗脱，10 mL正己烷淋洗即可使1,3-DCP与2,3-DCP发生明显的损失，3-MCPD与2-MCPD不易被正己烷洗脱；而20 mL和30 mL淋洗后，4种物质均有非常明显的损失。综合考虑，选择10 mL正己烷进行淋洗除脂。

2.3 洗脱体积对结果的影响

称取5份试样4 g液体样品进行加标实验，先使用10 mL正己烷淋洗，再分别用10 mL、15 mL、20 mL、25 mL和30 mL乙酸乙酯洗脱，检测洗脱液中氯丙醇含量。结果表明，4种氯丙醇的最佳洗脱体积均为25 mL，但1,3-DCP与2,3-DCP相比，3-MCPD与2-MCPD受洗脱体积的影响较小。在洗脱体积为15 mL时1,3-DCP与2,3-DCP洗脱含量约为最佳洗脱体积时的90%，3-MCPD与2-MCPD洗脱含量约为最佳洗脱体积时的80%。考虑到洗脱体积过大会显著增加后续氮吹的时间，增加检测成本，故洗脱体积确定为15 mL。

2.4 洗脱液吹干对结果的影响

氯丙醇为小分子化合物，沸点较低。为了考察溶液吹干对实验的影响，配备了含4种氯丙醇0.1 mg/L的溶液，一份在氮气下水浴吹干约5 min后拿出，2 mL正己烷复溶后衍生；另一份直接衍生。结果表明，1,3-DCP与2,3-DCP吹干后几乎全部损失，3-MCPD与2-MCPD吹干后也有较大损失，故洗脱溶剂切忌完全吹干。

2.5 衍生后溶液的稳定性

将衍生好的标准溶液分装在4个样品瓶中，分别在常温、避光常温、避光4 ℃和避光-18 ℃条件下保存，于0 d、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d时上机检测（每次进样后立即更换新瓶盖，并移至规定条件下保存），记录各化合物在不同保存时间的峰面积。结果发现，4种氯丙醇及4种内标化合物在各条件下均非常稳定，7 d内没有明显的峰面积改变，说明衍生后的溶液稳定性良好。

2.6 方法验证

2.6.1 检出限、定量限与线性范围

分别称取4 g空白样品，加入一定量的氯丙醇标准中间液，制备含4种氯丙醇的加标样品，经处理后按1.3.3条件进行检测，以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限。以化合物质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，得到回归方程，4种氯丙醇的检出限、线性范围与回归方程见表2。

表2 4种氯丙醇的检出限、定量限、线性范围与回归方程Table 2 Limits of detection,limit of quantitation,linear ranges and regression equation of 4 kinds of chloropropanols

由表2可知，3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP的检出限分别为2.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、5.0 μg/kg，定量限分别为5.0 μg/kg、5.0 μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg，在0.005～1.6 μg/mL质量浓度范围内具有很好的线性关系。R2均为0.999。

2.6.2 回收率与精密度实验结果

分别称取4 g空白样品，分别加入氯丙醇，制备成加标样品。每个质量浓度的加标样品各6份，经处理后采用1.3.3条件进行检测，扣除未加标样品本底值后计算4种氯丙醇的回收率和精密度实验结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3～表5。

表3 酱油中4种氯丙醇回收率与精密度（n=6）Table 3 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in soy sauce (n=6)

表4 鱼露中4种氯丙醇回收率与精密度（n=6）Table 4 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in fish sauce (n=6)

表5 水解植物蛋白液中4种氯丙醇回收率与精密度（n=6）Table 5 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in hydrolyzed vegetable protein liquid (n=6)

由表3可知，酱油中4种氯丙醇的平均回收率在85.9%～107.0%范围内，RSD在1.08%～8.58%范围内；由表4可知，鱼露中4种氯丙醇的平均回收率在85.6%～106.0%范围内，RSD在0.85%～4.69%范围内；由表5可知，水解植物蛋白液中4种氯丙醇的平均回收率在82.4%～103.0%范围内，RSD在1.25%～5.65%。说明该方法应用于液体调味料中4种氯丙醇的检测时，回收率及相对标准偏差均在合理范围，方法的稳定性良好，是一种科学、有效、准确的检验方法，可以作为同类食品检测氯丙醇含量的参考。

2.7 实际样品测定

随机在市场购买酱油、鱼露、水解植物蛋白液各10份样品，经处理后采用1.3.3条件进行检测，结果表明所有样品均未检出氯丙醇。

3 结论

采用商品化大孔硅藻土柱净化，结合气相色谱-质谱联用法检测，建立了一种前处理简单快捷的液体调味料中氯丙醇含量测定方法。该方法测定液体调味料中3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP的检出限分别为2.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、5.0 μg/kg，定量限分别为5.0 μg/kg、5.0μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg。加标回收率为82.4%～107.0%，精密度实验结果的相对标准偏差为0.85%～8.58%。方法验证实验结果表明，该方法重复性好、准确度高，可以为市场监管和检验检测提供技术保障。