加速溶剂萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中17种磺胺类药物残留

吉小凤，王小骊，吕文涛，周忠静，吴钰潇，杨 华，*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021； 2.农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021； 3.浙江工业大学 化学工程学院，浙江 杭州 310014)

随着人们生活水平提高和安全意识增强，动物源食品中兽药残留已逐渐成为人们关注的质量安全焦点之一。根据作用机理，兽药种类分为磺胺类(SAs)、喹诺酮类(Qs)、大环内酯类(MLs)、四环素类(TCs)、氨基糖苷类(AGs)、β-内酰胺类等[1]。磺胺类药物是一种广谱抗菌药，性质稳定，由于其抑制细菌生长的作用，被广泛应用于人类和动物胃肠道和呼吸系统疾病的预防和治疗[1-2]。由于磺胺类药物的半衰期较长，通过任何途径摄入的磺胺类药物均会在人体中蓄积，对人体产生一定的毒副作用，如造血紊乱，过敏反应，引起肠道菌群失调，影响人体免疫功能等[3]，这些危害对婴幼儿的影响更大。因此，很多国家对磺胺类药物的使用范围及其在动物源性食品中的残留限度进行了严格的规定。我国《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(GB 31650—2019)中规定乳中磺胺类药物最大残留限量为100 μg·kg-1，其中磺胺二甲基嘧啶最大残留限量为25 μg·kg-1[4]。近些年来，磺胺类药物在国内外牛奶和奶粉中均有残留检出。2019年，Moudgil等[5]对从印度旁遮普省9个区奶牛场的动物中采集的生奶样本进行检测，发现牛奶样品中磺胺甲噁唑检出率为0.6%。任孟伟[6]采用超高效液相色谱质谱联用法对30份不同品牌的奶粉和牛奶进行检测，发现在3批样品中检出磺胺硝苯，其测定值分别为0.05 μg·kg-1、0.16 μg·kg-1和0.18 μg·kg-1。

现有的奶粉中磺胺类药物残留检测前处理方法主要有固相萃取[7-8]和QuEChERS法[9-10]等。其中，固相萃取小柱价格高，操作繁琐，不适合于复杂样品基质的分析。QuEChERS法虽可用于多残留分析，但是吸附剂不能重复使用。加速溶剂萃取法通过使用少量有机溶剂及提高温度和压力来提高样品中化合物的萃取效率，与其他样品前处理技术相比具有自动化程度高、费时短、消耗溶剂少等优点。前期研究中加速溶剂萃取法用于各类基质中磺胺类药物的萃取已有报道。王静等[11]建立了加速溶剂萃取-全自动凝胶渗透色谱-高效液相色谱联用检测水产品中13种磺胺类药物的方法，13 种磺胺类化合物在0.01～1.00 mg·L-1线性关系良好，相关系数均大于0.999 9；添加100、200、400 μg·kg-1，3个浓度水平的平均回收率为77.9%～98.6%，相对标准偏差(RSD)为0.4%～13.4%。Zhu等[12]用加速溶剂萃取-萃取池内净化与超高效液相色谱质谱联用的方法分析了海参中21种抗生素(10种磺胺类药物、4种氟喹诺酮类药物、3种两性药物、2种β-内酰胺、1种林可酰胺和1种甲氧苄啶)。通过优化处理获得最佳工艺参数，使得目标分析物的回收率为50.1%～129.2%(RSD小于20%)，方法检出限在0.03～2.9 μg·kg-1。Alessandra等[13]用加速溶剂萃取-液相色谱质谱联用的方法分析了生肉和婴幼儿食品中13种磺胺类药物，样品中磺胺类药物加标回收率为70%～101%，检出限低于2.6 μg·kg-1。Konak等[14]分别用QuEChERS和加速溶剂萃取两种方法对婴儿食品中12种磺胺类药物及其衍生物进行分析，研究结果发现，QuEChERS方法的回收率范围为60.9%～85.9%，RSD≤ 19.1%；加速溶剂萃取方法回收率为75.5%～96.6%，RSD ≤ 10.1%。

目前，运用加速溶剂萃取法测定婴幼儿配方乳粉中的磺胺类药物残留却鲜有报道，因此，建立加速溶剂萃取前处理方法同时结合高效液相色谱-串联质谱实现高通量检测婴幼儿配方乳粉中的磺胺类药物残留的方法，对保障婴幼儿的食品安全具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

ASE 350加速溶剂萃取仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；高效液相色谱仪(日本岛津公司)；三重四极杆-线性离子QTRAP®6500阱复合质谱仪(美国AB Sciex公司)；TurboVap®LV自动氮吹仪(美国Biotage公司)；BS2202S电子天平(德国Sartorius公司)；SORVALL®Heraeus Biofuge冷冻高速离心机(德国Sartorius公司)；Talboys数显涡旋混合仪(美国Troemner公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

萃取池为34 mL，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；接收瓶，购自上海安谱实验科技股份有限公司；玻璃纤维纸直径为47 mm，购自英国Whatman公司；PTFE滤膜孔径为0.22 μm，购自北京迪科马科技有限公司；一次性使用无菌注射器为1 mL，购自上海康德莱企业发展股份有限公司；离心管为1.5 mL，购自德国Eppendorf公司；进样瓶为2 mL，购自北京迪科马科技有限公司；硅藻土为80～100目，购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

甲醇为HPLC级，购自德国Merck公司；乙腈为HPLC级，购自德国Merck公司；甲酸为HPLC级，购自美国ANAQUA公司；甲酸铵为HPLC级，购自美国ACROS Organics公司；实验用水为Milli-Q纯水仪制备的超纯水(≥18 MΩ·cm)；17种磺胺类药物标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，基本信息如表1所示。

表1 十七种磺胺目标抗生素基本信息表

1.2 混合标准溶液配制

混合标准储备液：分别准确称取适量各标准品，甲醇溶解，用甲醇(HPLC级)配制成含各磺胺类药物10 mg·L-1的混合标准储备液，于-20 ℃避光保存。

溶剂混合标准工作液：用甲醇-水(体积比1∶1)将混合标准储备液配制成系列浓度的混合标准工作液，现用现配。

基质混合标准工作溶液：用空白样品基质萃取液将混合标准储备液配制成系列浓度的基质混合标准工作溶液，现用现配。

1.3 样品前处理

基于前期加速溶剂萃取方法[13]，优化后的样品前处理方法如下：准确称取0.5 g样品(精确至0.01 g)。不锈钢萃取池(规格：34 mL)内垫入1张玻璃纤维纸，依次装入2 g硅藻土，0.5 g样品，3 g硅藻土。甲醇∶乙腈=1∶4(体积比)为萃取溶剂，萃取温度为60 ℃，加热时间为5 min，静态萃取时间为5 min，萃取循环次数为3次，冲洗体积为40%的条件下对样品进行加速溶剂萃取。所得萃取液采用TurboVap®LV全自动氮吹仪氮吹至干，然后用2 mL甲醇∶水=1∶1(体积比)复溶，利用Talboys数显涡旋混合仪涡旋30 s，再用超声波清洗器超声5 min，然后取1 mL上清液于1.5 mL离心管中，利用冷冻高速离心机10 000 r·min-1离心3 min，取全部上清液过0.22 μm PTFE滤膜，上机检测。

1.4 色谱条件

ACQUITY UPLC C18色谱柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流动相A：甲醇，流动相B：含0.1%甲酸和2 mmol·L-1甲酸铵的水溶液；流速：0.40 mL·min-1；梯度洗脱条件：0～2.0 min，95%～80% B；2.0～6.5 min，80%～1% B；6.5～8.0 min，1% B；8.0～8.1 min，1%～95% B；8.1～10.0 min，95% B。

1.5 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI)；检测方式为多反应监测(MRM)；扫描方式为正离子扫描；喷雾电压(IS)为 5 500 V；离子源温度(TEM)为450 ℃；雾化气(Gas1)压力为55 psi；辅助气(Gas2)压力为50 psi；气帘气(CUR)压力为40 psi；碰撞气为Medium；目标化合物多反应监测参数见表2。

表2 目标化合物多反应监测参数

2 结果与分析

2.1 方法验证

2.1.1 标准曲线、线性范围及检出限

对于线性范围确认，配制浓度为0.1、0.5、1、5、10 、50、100 μg·L-1磺胺类药物系列溶剂混合标准溶液及基质混合标准溶液，在设定的色谱和质谱条件下进行测定。选择空白婴幼儿配方乳粉样品，进行加速溶剂萃取，所得的空白基质溶液用于系列基质混合标准溶液配制。本研究以各目标化合物保留时间对应的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别得出溶剂和基质加标溶液标准曲线(表3)，以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)[15]。实验结果如表3 所示，17种磺胺类药物在各自的线性范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.998。婴幼儿配方乳粉中磺胺类药物的检出限为0.1～3.0 μg·kg-1，定量限为0.3～10 μg·kg-1(表3)，远低于国家标准对磺胺类药物限量检测要求和欧盟、日本等国家规定的最大残留量。

表3 十七种磺胺类药物的的线性范围、线性方程、相关系数和检出限

2.1.2 准确度和精密度

采用标准溶液添加法，用婴幼儿配方乳粉空白样品作为基质，添加3个不同水平的化合物，平行测定5次，计算回收率以及相对标准偏差(RSD)，评价方法的准确度和精密度(表4)。本研究分别添加10、20、50 μg·kg-1到空白基质样品中做添加标回收实验，不同添加浓度的回收率为75.3%～103.6%，RSD均小于11.0%，符合方法验证要求。

表4 十七种磺胺类药物在婴幼儿配方乳粉基质中的回收率及相对标准偏差(n=5)

2.1.3 基质效应

本研究通过配制浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg·L-1的系列基质加标溶液，同时配制系列相同浓度的溶剂标准溶液，在设定的色谱和质谱条件下进行分析测定，考察基质效应对目标化合物的干扰程度。通过比较基质加标溶液校准曲线方程的斜率和溶剂标准溶液校准曲线方程的斜率的比值，来判断基质效应的强弱[15]。若斜率比值为1，无基质效应；若斜率比值小于1，基质抑制效应；若斜率比值大于1，基质增强效应[16]。本研究中，磺胺类药物在婴幼儿配方乳粉中基质效应为0.4～1.0，多数化合物呈现基质抑制现象，详细信息见表3。为了准确定量目标化合物，减少质谱分析中的基质干扰，本研究采用基质外标法定量分析。

2.2 实际样品测定

采用建立的方法对市场随机采集的30批次婴幼儿配方乳粉样品进行17种磺胺类药物残留测定。结果表明，2批次的婴幼儿配方乳粉样品检出磺胺类药物，其中1批次样品检测出磺胺甲噻二唑，含量为3.4 μg·kg-1，另一批次样品同时检出磺胺甲噻二唑 (2.8 μg·kg-1)、磺胺邻二甲氧嘧啶 (1.5 μg·kg-1)和磺胺喹噁啉 (1.1 μg·kg-1)，样品中药物残留量均小于我国GB 31650—2019中乳中磺胺类药物残留的限量规定(≤100 μg·kg-1)。溶剂标准品，溶剂和基质标准品以及阳性样品色谱图如图1和图2所示。

图1 磺胺甲噻二唑标准品和实际样品色谱图

图2 磺胺喹噁啉标准品和实际检出样品色谱图

3 结论

本文建立一种基于ASE结合高效液相色谱-串联质谱同时检测婴幼儿配方乳粉中17种磺胺类药物残留的检测方法。与传统方法相比，ASE提取方法避免了前处理时间长，提取液易乳化等现象，实现全自动提取，提高了检测灵敏度，检出限远低于国家限量标准规定。 通过方法学考察及实际样品检测分析，该方法具有萃取便捷、灵敏度和准确度高等特点，能够满足国内外对婴幼儿配方乳粉中磺胺类药物残留的检测要求。