生物矿化合成鸟粪石晶体研究★

2023-02-21陶佳丽

山西化工 2023年1期

孙彬，陶佳丽

（山西工程技术学院，山西阳泉 045000）

引言

鸟粪石[Mg（NH4）PO4·6H2O]是一种常见的磷酸盐矿物，属于斜方晶系，存在于天然的鸟粪中。鸟粪石是一种富含氮、磷元素的天然肥料，具有重要的经济价值。随着天然鸟粪石的大量开采，现存的天然鸟粪石储量急剧下降；而现代农业对氮、磷肥料的需求与日俱增[1-2]。因此，实现鸟粪石的工业化生产十分必要。与常见的化学合成法相比，利用生物矿化得到鸟粪石晶体的方法，兼具经济效益和环境效益，逐渐引起了研究人员的重视。

河床底部存在大量污泥，厌氧区范围大且富含有机质，生存着大量的硫酸盐还原菌[3]，目前关于河床底部沉积物中的厌氧菌诱导鸟粪石矿物的研究较少。本文对河床底部污泥中的一株硫酸盐还原菌进行分离、鉴定，利用其成功诱导得到鸟粪石，具有重要的经济价值和研究价值。

1 实验方法

1.1 菌种来源

本实验所用样品取自河流底部的污泥。污泥中有强烈的H2S 气体的气味，表明污泥中含有丰富的硫酸盐还原菌。取深处污泥作为样品。

1.2 培养基

1.2.1 富集培养基

每1 L 富集培养基溶液所含成分如下：K2HPO40.5 g，NH4Cl 1 g，CaCl20.1g，MgSO4·7H2O 2 g，酵母浸粉1g，60%的乳酸钠溶液6 mL，Na2SO40.5 g，Fe（NH4）2-（SO4）20.5 g，抗坏血酸0.5 g，L-Cys 半胱氨酸0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH=6～8，121 ℃灭菌20 min。

Fe（NH4）2（SO4）2和抗坏血酸在高温环境性质会发生改变，所以先将其配制成溶液，0.22 μm 滤膜除菌。Fe（NH4）2（SO4）2中的Fe2+能与溶液中的S2-反应生成黑色的FeS，可作为硫酸盐还原菌富集成功的标志[4]。

1.2.2 纯化培养基

液体纯化培养基所含成分如下：酵母浸粉3 g，KCl 0.25 g，蒸馏水1000 mL。将其添加2%的琼脂即为固体纯化培养基。

1.3 菌株的富集与纯化

在200 mL 富集培养基中加入20 g 污泥样品进行培养，并用液体石蜡封闭瓶内液面，创造相对厌氧的环境。置于30 ℃恒温厌氧培养箱中静置培养。当培养基的颜色变成黑色时，表明此时培养基中存在大量的硫酸盐还原菌（图1）[5]。

图1 菌株富集培养

经过富集后的细菌培养液中存在多种细菌，需要固体培养基进行单菌落筛选，挑选单个菌落接到液体培养基中培养，反复进行多次，使菌种得到分离和纯化。将纯化后得到的单一菌株进行16S rDNA 分析鉴定。用透射电子显微镜观察菌株的形态学特征，并对菌株进行革兰氏、芽孢、接触酶、甲基红、V-P、硫化氢、运动性、三糖铁、脂酶、脲酶、蛋白酶、纤维素酶、明胶酶耐盐性等生理生化测试。

1.4 诱导矿化研究

诱导矿化所用培养基为富集培养基，其培养基成分变量为Mg、Ca。设置n（Mg）/n（Ca）比梯度0、2、4、6（表1）。设置实验组和对照组。实验组接菌量为1%，对照组中以等量蒸馏水替代菌量，30℃静置培养。

表1 诱导矿化梯度浓度Mg/Ca 比含量

2 结果与讨论

2.1 16S rDNA 分析

得到了长度为1 438 bp 的16S rDNA 序列，使用NCBI 在线blast 对该菌株的16S rDNA 序列进行同源性比对，结果发现，该菌株与肠杆菌属和非脱羧勒克菌属的同源性均在97%以上。通过基于16S rDNA 序列构建的系统发育树分析，结果显示该菌株与Leclercia adecarboxylata 亲缘关系最近（图2），因此可以确认该菌株为非脱羧勒克菌（Leclercia adecarboxylata）。

图2 菌株的系统发育树

2.2 菌体形貌特征

通过高分辨率投射电镜观察，菌株的基本特征为：菌体为短杆状，长约1 000 nm，宽约500 nm，生殖方式为二分裂（见图3）。

图3 菌株单细胞形态及生殖分裂方式透射电镜图

2.3 菌株的生理生化鉴定

如表2 所示，结果表明，该菌株为革兰氏阴性杆菌，不形成芽孢，有动力，不耐盐。接触酶，淀粉酶为阳性；MR 为弱阳性；脂酶，脲酶，蛋白酶，纤维素酶均为阴性；可利用乳糖发酵；不能利用含硫氨基酸产硫化氢，但可利用含硫化合物。

表2 该菌株与同种非脱羧勒克菌的鉴别结果比较

2.4 诱导矿化结果

诱导矿化18 d 后，在显微镜下观察实验组的沉淀。从图4-1、4-2 可知，Mg/Ca 比为0 和2 的情况下，没有矿物形成；从图4-3、图4-4 可知，n（Mg）/n（Ca）比为4 和6 的情况下，有规则矿物形成。对照组中没有矿物沉淀。这些结果说明细菌对矿物的沉淀有促进作用，同时n（Mg）/n（Ca）比同样对矿物的形成有重要影响。

图4 实验组矿物的显微镜图像（a、b、c、d 分别为n（Mg）/n（Ca）比0、2、4、6 的培养基矿物）

XRD 结果（第18 页图5）可以看出，n（Mg）/n（Ca）比为0 和2 的实验组均未形成晶形矿物，而n（Mg）/n（Ca）比为4 和6 的实验组均出现明显特征峰。通过晶体比对，n（Mg）/n（Ca）比为4 和6 的实验组所形成的矿物均为鸟粪石。与鸟粪石标准PDF 卡片（晶格参数为a=6.945，b=11.208，c=6.135）的峰强和峰位相比较，峰强十分相近，半峰宽略大，而且本实验所得鸟粪石晶体XRD 衍射峰位相对标准峰位左移，也就是说，生物诱导的鸟粪石与自然形成的鸟粪石相比，原子排列结构相同，但结晶程度略低，晶胞尺寸较大，晶形发生畸变。这表明细菌对晶核形成及晶体生长过程具有一定的影响。