基于部分碳化NH2-MIL-101(Fe)的水中四环素类抗生素比色检测方法研究❋

2023-02-21杨翔昊孙翠竹李媛媛徐功娣李锋民

中国海洋大学学报（自然科学版） 2023年2期

杨翔昊, 郭威, 孙翠竹, 李媛媛, 徐功娣, 李锋民

(中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东青岛 266100)

抗生素作为一种广谱类药物，成本低、副作用小且具有高效抗菌性能，已广泛应用于医疗领域[1]。其中，四环素类抗生素(Tetracyclines, TCs)具有价格低、见效快等特点，是动物制药和饲料生产中的首选抗菌剂，在全世界抗生素生产使用总量中排名第二，且在中国的抗生素使用中是最为频繁的一类[2-3]。然而，由于在动物体内代谢吸收不完全，70%～90%的TCs会以排泄物的形式进入到土壤以及水环境中[4]。残留在环境中的四环素具有持续性强、不易降解等特性，可能导致细菌基因突变，产生耐药菌，从而影响细菌感染的治疗效果，经食物链传递进入人体后会引发人体肠道菌群紊乱，危害人体健康[5-6]。

现有的TCs检测方法主要包括液相色谱-质谱法、酶联免疫吸附法[7]、分子印迹法[8]、适体抗体检测法[9-10]、光电化学检测法[11]、荧光检测法[12]、表面增强拉曼散射法[13]等。然而，这些检测方法大多需要庞大、昂贵的仪器、繁琐的检测过程且对操作人员的专业技术要求较高，应用范围十分受限。因此，建立一种简单，灵敏，准确度高的水中TCs检测方法具有重要的意义。

近年来，比色法因具有测定快速、成本低、不需要精密仪器、可通过肉眼直接观察等优点，在检测领域受到广泛的关注[14-15]。基于天然酶建立的比色传感器过程简单、效率高[16-17]，但天然酶的操作稳定性低(变性和消化)、制备和纯化成本高且回收利用困难。此外，酶活性容易受到pH值、温度和抑制剂等环境因素的干扰，应用于比色分析时存在缺陷[18-19]。

纳米材料作为天然酶的新兴替代品，能够耐受苛刻的反应条件，展现出良好的应用前景[20-21]。其中，金属有机骨架(Metal Organic Framework, MOF)是一类由有机配体交联的金属离子所组成的多孔纳米材料[22]。陈红霞等人使用Cu-MOF作为框架，制作出一种能够模拟血红蛋白和Fe-N5双活性位点的高效、稳定的人工酶催化剂[22]；李风亭等人发现Fe-MOF对H2O2的分解具有高效催化效果，并利用适体与靶分子结合会强烈抑制Fe-MOF的催化活性这一原理，设计出一种无标记的生物分子比色传感器[22-23]。尽管MOFs在检测应用中表现出巨大的潜力，但是在水中稳定性较差。实现MOFs的信号转导放大并增强稳定性，是应用MOFs构建选择性好和灵敏度佳的检测平台的关键[24]。

刘玉堂等人研究发现，在惰性气氛中对Fe-MOFs进行热活化可以去除其孔隙中的预配位分子及杂质(H2O, F-, O)，产生更多可作为路易斯酸位点和活性中心的协调不饱和金属位点(Coordinated unsaturated metal sites, CUS)[25-26]。Fe-MOFs在惰性气氛中的热解规律主要分为以下四个部分：(1)10～300 ℃时孔隙中分子的脱附；(2)300～350 ℃时有机配体开始分解；(3)350～600 ℃时进一步发生碳化；(4)600 ℃后碳化完全[27-28]。过高的热解温度会导致MOF表面产生疏水碳层，不利于其在水中的分散[29]。因此，确定适合的煅烧温度，在保证亲水性的同时达到活化效果，对提高材料在非均相体系中与TCs的络合能力十分重要。

研究表明，NH2-MIL-101(Fe)具有丰富的铁活性位点，可以在4～80 ℃的温度范围及2～10的pH范围内表现出较强的类过氧化氢酶活性[30]。本文选取350 与450 ℃两种热解温度，通过惰性气氛煅烧法对NH2-MIL-101(Fe)进行改性，制备兼具水稳定性和催化能力的衍生材料。基于材料与TCs间的络合倾向，设计了一种可视化比色检测方法，检测机制是在室温、弱酸性条件下，TCs与材料的络合物能够催化H2O2生成活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)，从而氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Teramethylbenzidine, TMB)生成oxTMB，溶液显蓝色。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

土霉素(Oxyetracycline, OTC)购自北京索莱宝科技有限公司，四环素(tetracycline, TC)、购自德国钻石试剂有限公司，磺胺甲恶唑、阿莫西林、氨苄青霉素、头孢拉定购自美国Sigma-Aldrich，诺氟沙星购自上海生工生物技术有限公司，2-氨基对苯二甲酸、TMB购自罗恩试剂有限公司，FeCl3·6H2O、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide, DMF)、30%H2O2、醋酸钠、冰醋酸、二甲亚砜、购自国药集团试剂有限公司，所有试剂均为试剂纯，无需纯化即可使用。

利用扫描电子显微镜(SEM，Hitachi S-3600，日本)与透射电子显微镜(TEM，JEOL JEM-2100F，日本)对比材料热解后的表面形貌及内部结构，在X-射线衍射仪(XRD，PANalytical X’pert3 Powder，荷兰)上使用Cu Kα辐射进行X射线衍射实验，比较3种材料的晶体结构，2θ范围为5°～80°，扫描时间为10 min。材料的表面化学态通过Al Kα源的X射线光电子能谱仪(XPS，Thermo Fisher Escalab250Xi，美国)测定。使用紫外-可见光分光光度计(UV-9000S，元析，上海)测定吸光度值，验证材料对H2O2-TMB混合液的催化效果。使用高效液相色谱仪(HPLC，Thermo Fisher Ultimate 3000，美国)同步测定实际水样中的OTC含量，验证比色检测方法的准确性。

1.2 实验方法

1.2.1 材料的制备 NH2-MIL-101(Fe)是通过改进前人的方法制备得到的[31]。将0.540 6 g(2 mmol) FeCl3·6H2O和0.181 1 g(1 mmol) 2-氨基对苯二甲酸混合在30 mL 的DMF中，超声10 min使固体完全溶解。将获得的橙色溶液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在110 ℃真空烘箱中加热20 h后，8 000 r·min-1离心5 min，获得红棕色沉淀物。用DMF与乙醇洗涤3次， 65 ℃真空干燥12 h，得到NH2-MIL-101(Fe)。

干燥的NH2-MIL-101(Fe)置于陶瓷舟中，分别在 350和450 ℃下的N2气氛中，以3 ℃·min-1的升温速率煅烧3 h制备获得部分碳化材料。所制备的材料命名为101-T，其中T为煅烧温度。

1.2.2 3种材料催化活性的比较与检测方法的优化制备好的NH2-MIL-101(Fe)、101-350、101-450分别在去离子水中超声分散10 min，获得催化剂储备液。将280 μL OTC标准溶液、30 μL H2O2溶液、30 μL 催化剂储备液依次添加到140 μL 醋酸钠缓冲液中(pH=5.5)，立刻添加20 μL二甲亚砜溶液(TMB)。混合液(500 μL)在室温下反应30 min后，分别测定652 nm处吸光度值，比较3种材料的催化性能。

材料的催化性能可能会受到H2O2溶液浓度、TMB溶液浓度、催化剂投加量、混合液的pH值、反应时间的影响，因此采用单因素法对这些影响因素进行优化：(1)H2O2溶液浓度设置为1.2、1.8、3、4.2、6、7.8 mmol·L-1，(2)TMB浓度设置为0.5、1.5、3、5、7、10、12 mmol·L-1，(3)催化剂浓度设置为4、8、12、16、20 μg·mL-1，(4)缓冲液的pH值设置为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8，(5)反应时间设置为5～52 min，OTC实验浓度始终采用1 μmol·L-1。

1.2.3 比色检测方法对OTC的检测能力分析将适量的OTC溶解到去离子水中，制备0.1、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10、25、50 μmol·L-1标准样品。将280 μL 不同浓度的OTC溶液分别添加至140 μL 醋酸钠缓冲液(pH=5.5)中，再依次添加30 μL H2O2溶液(6 mmol·L-1)、30 μL 101-350储备液(12 μg·mL-1)、20 μL TMB溶液(5 mmol·L-1)。将混合液在室温下放置40 min后，测定652 nm处的吸光度值以评估检测方法的性能。阿莫西林、磺胺甲恶唑、诺氟沙星、氨苄青霉素、头孢拉定(5 μmol·L-1)和四环素(1 μmol·L-1)也在相同的条件下检测以揭示该检测方法的选择性。

1.2.4 比色检测方法对实际水体中OTC的检测性能验证 3种试验用水分别为采自李村河的景观回用水、三文鱼养殖场排水口水样、流清河入海口水样，分别配制成0.25、0.5、1、2.5、5 μmol·L-1OTC加标溶液，以模拟含TCs的再生水、养殖废水以及入海口地表水。在优化的实验条件下，通过上述检测方法测定加标水样中的OTC含量，探究该方法检测实际水体中TCs的性能。采用HPLC法对上述水样进行同步测定，验证比色检测方法的准确性。

1.3 数据分析

所有实验均进行3次重复测定，实验结果表达为3次测定的平均值±标准差(SD)。从检测仪器和智能手机中导出数据及图片，采用SPSS 19.0软件进行数据分析，使用Origin 2018软件进行绘图，采用单因素ANOVA检验进行差异性分析，显著性水平为p<0.05。利用公式(1)计算检测方法的检出限，利用公式(2)计算方法检测实际水样的相对标准偏差。

MDL=t(n-1,0.99)×S。

(1)

(2)

2 结果与讨论

2.1 NH2-MIL-101(Fe)、101-350、101-450的制备表征

材料的晶相结构会影响其稳定性和化学组成，因此，为探究高温煅烧对材料的晶相结构的影响，对3种材料的物相和结晶度进行了表征(见图1)。所合成的NH2-MIL-101(Fe)衍射峰与之前文献报道的图谱一致[31-32]，表明NH2-MIL-101(Fe)前体的成功合成。与前体相比，高温煅烧材料101-350的衍射峰表现出明显减弱，是因为350 ℃的煅烧在晶体表面形成薄碳层，使材料结晶度下降。随着煅烧温度的升高， 101-450具有归属于Fe3O4(JCPDS No.72-2303)的一系列XRD特征峰[33]。表明经过450 ℃的煅烧，NH2-MIL-101(Fe)已经完全转变为Fe3O4的单一纯晶相。

图1 不同煅烧温度下获得的3种材料的XRD图谱

为了探究煅烧温度对材料晶体形貌的影响，通过SEM、TEM对NH2-MIL-101(Fe)以及101-350、101-450的表面形貌和结构进行了表征，结果如图2所示。从图2((a), (d))可以看出，合成的NH2-MIL-101(Fe)前体呈现出典型的八面体结构，表面光滑，粒径范围为300～500 nm。从图2(b)与图2(e)中发现，经过350 ℃煅烧后的NH2-MIL-101(Fe)虽然保持着前体的八面体结构，但表面变粗糙，内部产生细小的纳米晶体以及纳米孔，尺寸减小，表明高温热解使NH2-MIL-101(Fe)发生了碳化，晶体受热分解并收缩，杂质被去除，内部生成α-Fe2O3小颗粒[32]。450 ℃下高温煅烧的NH2-MIL-101(Fe)(见图2((c), (f)))晶体结构被破坏，内部产生较大粒径的Fe3O4颗粒，这与2.1的表征结果一致。

图2 3种材料的SEM、TEM图像

为进一步探究不同煅烧温度对NH2-MIL-101(Fe)表面官能团的影响，对三种材料的化学键和化学基团进行了表征。如图3(a)所示，NH2-MIL-101(Fe)前体以及煅烧后的材料都是由Fe、C、O三种主要元素组成的，N元素来源于2-氨基对苯二甲酸作为连接配体合成MOF时所携带的氨基。350 ℃煅烧后，101-350的O/Fe值明显低于NH2-MIL-101(Fe)，归因于煅烧去除了前体中残留的H2O和O从而将更多的Fe-CUS暴露出来。101-450中O/Fe值的进一步减少和C 1s峰的增加则与碳化加剧相关。与已有的研究一致，王建龙、李传浩研究发现， NH2-MIL-101(Fe)的Fe 2p谱图(见图3(b))显示出两个拟合峰， Fe3+的对应峰是在2p1/2和2p3/2处结合能分别为726.3、712.8 eV(对应于Fe3+的μ3-OFe键)和724.9、711.4 eV(对应于Fe3+的Fe—O—C键)的强峰，同时还观察到结合能为710 eV(对应于Fe2+)的弱峰[33-34]，在经过惰性气氛煅烧后，101-350与101-450在723.5 eV(对应于Fe2+)处出现特征峰，710 eV处的峰也观察到明显的增加，表明高温煅烧会还原Fe3+生成Fe2+[33]，在717.1 eV处Fe3+卫星峰的减少则说明煅烧后材料稳定性的提高。图3(c)的C 1s谱图在284.8(对应于C—C)、286.1(对应于C—O—C)和288.7 eV(对应于O—C=O)处的三个特征峰，与苯环和羧基有关。对于图3(d)中O 1s的XPS谱图在530、531.7、532.8 eV处出现的三个峰分别与有机连接体中的Fe—O、Fe—O—C和C=O有关[35-36]。随着煅烧温度的升高，101-350与101-450的Fe—O峰显著增加，并向高结合能的方向移动，可能是由于材料的部分碳化所导致。

图3 3种材料的XPS谱图

2.2 101-350的催化能力验证及3种材料的催化性能对比

NH2-MIL-101(Fe)在H2O2存在时能催化TMB产生蓝色的oxTMB[16,23]，因此对本研究中制备的101-350的催化能力进行了验证。如图4，在TMB溶液中单独加入H2O2溶液或101-350时(见图4(f),(g))，混合液在652 nm处无吸收峰。H2O2与101-350同时存在于TMB溶液中时，吸光度升高至1.229 2(见图4(d))，证明101-350在H2O2存在时具有催化TMB氧化的能力。由于OTC分子中具有较多的含氧官能团，能够促进其与101-350中铁离子的络合，因此选取OTC作为TCs的代表，将1 μmol·L-1的OTC溶液添加至含有催化剂的混合液中后，混合液的吸光度升高至1.732 2，OTC含量越高，吸光度越强，颜色越深(见图4(a)—(c))。以上结果均表明，以101-350作为催化剂建立TCs检测方法具有可行性。

((a)101-350—H2O2—TMB—OTC(1 μmol·L-1)、(b)101-350—H2O2—TMB—OTC(500 nmol·L-1)、(c)101-350—H2O2—TMB—OTC(100 nmol·L-1)、(d)101-350—H2O2—TMB、(e) 101-350—TMB—OTC(1 μmol·L-1)、(f)101-350—TMB、(g)H2O2—TMB.)

为了比较以NH2-MIL-101(Fe)、101-350、101-450作为催化剂的检测方法的灵敏度，通过线性拟合3种材料作为催化剂的OTC浓度-吸光度曲线，以斜率作为增长速率比较了3种材料对 OTC的响应能力。如图5所示，以NH2-MIL-101(Fe)为例，与H2O2-TMB混合后，随OTC浓度的升高，吸光度显著增加，吸光度随OTC浓度的增长速率为0.062 8。101-350、101-450也表现出类似的趋势，增长速率分别是0.091 5和 0.052 1。综上，3种材料对OTC的响应能力为101-350> NH2-MIL-101(Fe)>101-450。据陈代荣等人研究发现，经过350 ℃高温煅烧后， NH2-MIL-101(Fe)的多孔通道中所吸收的DMF、乙醇和水蒸气被蒸发，产生Fe-CUS，可以为反应提供更多的活性位点[27]。101-450催化效果的下降可能是由于过高的温度导致材料的晶相、结构过度破坏，使其分散性和催化性能降低[37]。因此，在350 ℃下煅烧的材料101-350具有最佳催化效果，之后的实验均采用基于101-350建立的比色检测方法。

图5 3种材料与OTC的响应能力

2.3 基于101-350的TCs比色法及条件优化

为了对基于101-350的比色检测方法进行优化，应用单因素实验比较了不同H2O2浓度、TMB浓度、催化剂投加量、缓冲液pH值和反应时间下比色检测方法对OTC的检测性能，结果如图6所示。随催化剂添加量的增加，吸光度差呈现先升高后趋于稳定的趋势，表明过量的催化剂投加量不会进一步改善检测效果，因此，最佳催化剂投加量选择12 μg·mL-1(见图6(a))。同样的，当H2O2浓度与TMB浓度分别从1.2升至7.8 mmol·L-1、0.5增加至12 mmol·L-1时，吸光度也呈现出相同的变化趋势(见图6(b),(c))，因此H2O2和TMB的最佳浓度分别选择7.8 和5 mmol·L-1。然而，在pH值的变化上呈现出不同的趋势(见图6(d))。pH<5时，有无添加OTC的溶液均显示出强催化活性，pH=5.5时吸光度差达到最大，这可能是因为101-350中的Fe2+在弱酸性条件下会发生自氧化，从而促进其与OTC间的络合[38]。此外，反应时间达到40 min 后，溶液的吸光度差值趋于稳定(见图6(e))。综上，基于101-350的比色检测方法的最佳反应条件设定为：催化剂投加量 12 μg·mL-1、H2O2浓度 6 mmol·L-1、TMB浓度 5 mmol·L-1、pH=5.5、反应时间 40 min。

(A0：无OTC时的吸光度值，A：含OTC时的吸光度值，ΔA=A-A0。A0: Absorption intensity without OTC. A: Absorption intensity with OTC. ΔA=A-A0.)

2.4 基于101-350的比色检测方法在实际水体TCs检测中的应用

为检验基于101-350的比色检测方法的实用性，在优化的实验条件下，以景观再生水、养殖废水及入海口地表水作为代表，通过检测0.25～5 μmol·L-1加标样品中OTC的回收率，验证该方法检测实际水体中OTC含量的可行性。首先，设置了一组具有浓度梯度的OTC标准溶液，随着OTC浓度由50降至0.1 μmol·L-1，溶液颜色自深蓝梯度变化至浅蓝(见图7(a))。在0.1～50 μmol·L-1的浓度范围内，吸光度差值与OTC浓度之间显著相关(R2=0.982 2)，检出限估计为71.42 nmol·L-1(见图7(b))。经测定，在3种实际水体的检测中，本方法的回收率在92.1%～111.5%，RSD<10%(n=3)，且与HPLC法对相同OTC浓度水平的检测结果间无显著性差异(p>0.05)(见表1)，表明该方法具有良好的稳定性和可靠性。因此，基于101-350的比色检测方法可应用于再生水、养殖废水及地表水中TCs的检测，且前处理简单、易操作、耗时短。

图7 方法检测不同浓度OTC的颜色变化照片和吸光度值校准曲线

表1 检测方法对实际水体中的OTC含量测定分析结果

续表1

2.5 基于101-350的比色检测方法的选择性分析

为评估基于101-350的比色检测方法的选择性，对比了该方法对OTC、TC(1 μmol·L-1)、磺胺甲恶唑、诺氟沙星、阿莫西林、氨苄青霉素、头孢拉定(5 μmol·L-1)的检测效果。如图8所示，检测方法对OTC与TC两种TCs表现出明显的吸光度值变化，分别达到0.495 3和0.310 1，且溶液变蓝，而对其他5种抗生素无显著响应。上述结果表明，以101-350作为催化剂的比色检测方法对水环境中存在的TCs具有良好的选择性。

(a：土霉素, b：四环素, c：氨苄青霉素, d：磺胺甲恶唑, e：诺氟沙星, f：阿莫西林, g：头孢拉定, h：空白。a: Oxytetracycline, b: Tetracycline, c: Ampicillin, d: Sulfamethoxazole, e: Norfloxacin, f: Amoxicillin, g: Cefradine, h: Blank.)