经典名方麦门冬汤化学成分的UPLC-Q-Orbitrap-MS分析

范倩，吴晓纯，蔡盛康，陶晨璐，朱德全，陈向东，沈斌斌，孙冬梅

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山 528244）

麦门冬汤出自汉代张仲景《金匮要略》一书，由麦冬、法半夏、人参、甘草、粳米和大枣6 味中药组成，具滋养肺胃、降逆下气的功效，临床主要应用于慢性萎缩性胃炎、慢性咽炎、慢性支气管炎、慢性肺纤维化和糖尿病等疾病的治疗[1-2]。慢性萎缩性胃炎是常见、多发的、长时间治疗难以痊愈的消化系统多发疾病之一，以反酸、餐后饱胀、食欲不佳、腹痛等为主要症状，且症状常反复发作[3]。麦门冬汤疗效确切，临床应用广泛，是国家发布的《古代经典名方目录（第一批）》中所载方剂之一。目前，关于麦门冬汤在治疗慢性萎缩性胃炎的临床报道较多，然而对其中药化学物质基础却缺乏系统性的研究。

《金匮要略》（汉·张仲景）中记载麦门冬汤的煎煮及服用方法“麦门冬七升，半夏一升，人参二两，甘草二两，粳米三合，大枣十二枚。上六味，以水一斗二升，煮取六升，温服一升，日三夜一服。”[1]参照《经方本原剂量问题研究》中东汉时期度量衡换算标准，所得用量明显大于现代临床用量。后世对该方用量进行了调整，在基本保留原方各药味用量比例关系的基础上，用量进行了下调，如《张氏医通》等[4-5]。根据明朝李时珍汉唐“一两”约合明代“一钱为3.73 g”的标准，换算结果为：人参用量3.73 g/钱×2 钱=7.46 g。以人参用量为基准，等比例换算出其他药味剂量，确定了麦门冬汤处方组成为麦冬130.55 g、法半夏18.65 g、人参7.46 g、甘草7.46 g、粳米5.60 g、大枣9.70 g[4-5]。超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q-Orbitrap -MS）具有高分辨率、高扫描速率、精确的结构表征等优势，可实现多种成分同时快速地鉴定和指认，已被广泛应用于中药单体及复方化学成分的快速筛查和定性分析[6]。因此，本研究拟采用UPLC-QExactive Orbitrap-MS 技术快速分析麦门冬汤化学成分组成，对全方中6味药同时实现了鉴别，为麦门冬汤药效物质基础研究及其未来现代制剂质量标准制定提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪、Ultimate 3000 超高效液相色谱系统（美国赛默飞世尔科技公司）；数据处理系统为Xcalibar 4.1 工作站（美国赛默飞世尔科技公司）；ME204E 十万分之一天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-3000E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Direct-Q5型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

甲基麦冬二氢高异黄酮A 对照品、甲基麦冬二氢高异黄酮B 对照品、异甘草苷对照品和甘草素对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为wkq19011510、wkq19011510、wkq18042008、wkq18030505，纯度均大于98.00%）；人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re 对照品、人参皂苷Rb2对照品、人参皂苷Rd 对照品、人参皂苷Rf 对照品、甘草苷对照品和甘草酸铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110703-201933、110704-202028、110754-201827、111715-201203、111818-201603、111719-201806、111610-201607、110731-201720，纯度分别为93.4%、93.1%、93.4%、93.8%、92.1%、供鉴别用、93.1%）；人参皂苷Rc 对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号为MUST-18032302，纯度为99.7%）；麦冬皂苷D 对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号为18012909，纯度为98%）。麦冬、人参、甘草、粳米、大枣饮片（广东一方制药有限公司，批号分别为GP1903282、GP1810240、GP1812001、GP1908023 和GP1809185）、法半夏（四川天雄药业有限公司，批号为GP11904034），经广东一方制药有限公司孙冬梅主任药师鉴定，分别为麦冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥块根，五加科植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.干燥根和根茎，禾本科植物稻（粳稻）Oryzasativa L.以及鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实，天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎的相关炮制加工品，均符合2020 年版《中国药典》（一部）中的相关规定。水为超纯水，甲醇和乙腈为色谱纯，甲酸为质谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 Waters CORTECS T3 C18（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）色谱柱；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～8 min，5%～18%B；8～11 min，18%～20%B；11～21 min，20%～21%B；21～23 min，21%～28%B；23～29 min，28%～30%B；29～38 min，30%～38%B；38～47 min，38%～55%B；47～54 min，55%～65%B）；流速为0.3 mL/min；柱温为30°C；进样量为2µL。

2.1.2 质谱条件 HESI 离子源，正、负离子监测模式；裂解电压3.80 kV；辅助气流量10 mL/min；离子传输管温度320 ℃；辅助气温度350 ℃；扫描模式Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；质量扫描范围m/z100～1 500。MS/MS模式时，正负离子模式下的碰撞能均为20 eV，以亮氨酸脑啡肽为内标校正质量精度。

2.2 供试品溶液制备

根据处方考证结果，确定麦门冬汤的制备工艺为：称取麦冬130.65 g、法半夏18.76 g、人参7.33 g、甘草7.43 g、粳米5.65 g、大枣9.74 g，加水2 400 mL，浸泡后采用传统砂锅先武火沸后文火煎煮至1 200 mL，滤过，滤液采用旋转蒸发仪浓缩至约450 mL的浓缩液，取浓缩液冷冻干燥，即得麦门冬汤冻干粉。精密称取麦门冬汤冻干粉1.0 g，置具塞锥形瓶中，加75%（体积分数，下同）甲醇25 mL，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加75%甲醇使溶解，转移至5 mL 量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，0.22 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得，麦门冬汤供试品溶液。各单味药的制备工艺如上，分别同法制备麦冬、法半夏、人参、甘草、粳米、大枣6味单味药供试品溶液。

2.3 对照品溶液制备

精密称取甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、麦冬皂苷D对照品适量，加75%甲醇使溶解，作为混合对照品溶液1；精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rd 对照品适量，加75%甲醇使溶解，作为混合对照品溶液2；精密称取甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸铵对照品适量，加75%甲醇使溶解，作为混合对照品溶液3。

2.4 数据处理

根据一级质谱提供的精确相对分子质量，采用Xcalibar 2.0 软件计算可能的分子式（误差范围±5.0 ppm，1 ppm=1×10-6），将其他未知化合物的二级碎片离子与对照品、中药成分高分辨质谱数据库（OTCML）、mzVault 2.0 质谱数据库、Compound Discoverer 3.0 软件、Mass Frontier 8.0软件结合相关文献报道提供的裂解碎片进行比对，并根据二级碎片离子推导化合物的质谱裂解规律，进一步确定未知化合物的分子式及结构。对于化合物中部分同分异构体的鉴别，可通过与对照品比对或裂解规律的不同进行区分；对于裂解路径一致的同分异构体，主要采用ChemBioDraw Ultra 12.0 软件给出的有机化合物疏水常数（logP）对极性大小进行判断，同时结合文献中化合物的保留时间（tR）进行推测。

3 结果

3.1 化合物鉴定

采用UPLC-Q-Orbitrap-MS 在“2.1”检测条件下对供试品溶液和对照品溶液分别进行分析，得正、负离子模式下的总离子流图（见图1）。按照“2.4”数据处理方法，最终在麦门冬汤中鉴定出141 个化合物，包括黄酮及其苷类54 个、高异黄酮类27 个、三萜及其苷类40个、甾体皂苷类7个、苯丙素类7个和其他类6 个；其中14 个成分通过与对照品对比确认，单味药归属，各化学成分的保留时间（tR）、准分子离子峰质荷比的测量值、碎片离子等数据见表1。

图1 麦门冬汤的UPLC-Q-Exactive MS的正离子（A）和负离子（B）总离子流图Figure 1 Total ion chromatograms of UPLC-Q-Exactive MS of Maimendong Decoction in positive mode(A)and negative mode(B)

表1 麦门冬汤中化合物的UPLC-Q-Exactive MS定性分析结果Table 1 Qualitative analysis results of chemical constituents in Maimendong Decoction by UPLC-Q-Exactive MS

续表1

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3.2 麦门冬汤中主要化学成分的质谱裂解规律

3.2.1 黄酮类化合物 黄酮类化合物是麦门冬汤中主要的一类活性成分，该类化合物主要来自于麦冬、甘草和大枣，既有黄酮苷元，也有含糖基的黄酮苷。甘草中含有丰富的黄酮，其相关裂解规律的文献报道较多[7]，黄酮苷多见丢失相应糖基的苷元离子，其裂解规律与相应苷元的准分子离子裂解规律一致。此外，对于黄酮及其苷类化合物的裂解，容易失去连在环上的取代基如羟基和甲氧基等；以及黄酮母核C 环的开裂或者重排，多可观察到CH3、CO、HCO、CO2、CH2O2和C4H8等的中性丢失。C 环的开裂产生的离子对于母核的推断具有重要的意义，本研究基于UPLC-Q-Exactive MS高分辨质谱共鉴定了54个黄酮类化合物。

通过建立的LC-MS方法，在麦门冬汤中一共鉴别了32 种黄酮类化合物。为了帮助鉴定和证实其他黄酮类化合物，以甘草素为例阐述其可能的裂解规律。峰34（tR=20.56 min）在正离子模式检测下，可以观察到准分子离子峰为m/z257.081 0[M+H]+，利用软件Xcalibur 4.0 分析其元素组成并推导其可能的分子式为C15H12O4，二级质谱图可观察到碎片离子239.070 5 [M+H-H2O]+、211.075 3 [M+HC2H6O]+、163.039 5[M+H-C6H6O]+和137.023 4[M+H-C8H8O]+，通过相关文献报道[7-10]及对照品比对，推测峰34 为甘草素，其可能的裂解规律见图2。在麦门冬汤中共鉴定了22 种黄酮苷类化合物。峰16（tR=11.63 min）和30（tR=19.34 min）通过标准品无偏差地鉴别为甘草苷和异甘草苷。这里以负离子模式下的部分黄酮苷类化合物为例解析其裂解规律，例如峰16母离子为m/z417.119 9[M-H]-，其二级质谱主要的碎片离子为255.066 5[M-H-Glc]-、227.196 9[M-H-Glc-CO]-、135.007 8[M-H-Glc-C8H8O]-，通过相关文献报道[7-11]及对照品比对，推测峰16为甘草苷。

图2 甘草素可能的裂解规律Figure 2 The possible fragmentation pathway of Liquiritigenin

3.2.2 高异黄酮类化合物 共鉴别了27种高异黄酮类化合物，主要来源于麦冬。麦冬黄酮为百合科沿阶草属特有高异黄酮，此类化合物结构较异黄酮类化合物多1个碳原子，由色原酮、色满酮的C3位接苄基而形成的一系列衍生物，为一类特殊的黄酮类化合物。根据所鉴定黄酮的碎裂规律，C 环与B 环连接键均易发生断裂，A 环骨架较稳定。与对照品峰保留时间和二级质谱图对比，确认峰134 为麦冬二氢高异黄酮A，峰136为麦冬二氢高异黄酮B。以麦冬二氢高异黄酮A 为例，峰134 在正离子模式检测下，准分子离子峰为m/z343.118 2 [M+H]+，在负离子模式下检测到m/z341.103 6 [M-H]-，利用软件Xcalibur 4.0分析其元素组成并推导其可能的分子式为C19H18O6。在正离子模式下，二级质谱图可见m/z325.108 1[M-H-H2O]-、207.065 5[M-H-C8H8O2]-、189.055 6[M-H-C8H8O2-H2O]-和135.044 2[M-HC12H10O2]-的碎片离子，经与对照品对比，确定该化合物为麦冬二氢高异黄酮A，结合文献报道[12-15]和特征离子碎片推测其可能的裂解途径见图3。

图3 麦冬二氢高异黄酮A的裂解规律Figure 3 The fragmentation pathway of Ophiopogonanone A

3.2.3 三萜类化合物 共鉴定出40 种三萜类成分，包括三萜及其苷类，主要来源于人参、甘草、大枣和粳米。此类成分的LC-MS 总离子流图在正负离子模式下均有较好的响应度，在负离子模式下容易形成[M-H]-和[M+HCOO]-的准分子离子，而在正离子模式下，被电离的分子易结合氢和钠离子而形成[M+H]+和[M+Na]+的准分子离子。人参皂苷类成分大多具有相同的基本结构，其母核结构大部分是由17 个碳原子组成的四元环，来源于甘草、粳米和大枣的三萜及其苷类属于五环三萜型。同时，其苷元母核结构中含有葡萄糖醛酸（Glc A）、葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）及木糖（Xyl）等糖链。因此，该类化合物在质谱条件下主要发生糖链、侧链的裂解和脱水。

共鉴定了四环三萜类皂苷16种，其中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2和人参皂苷Rd是通过与对照品峰保留时间和二级质谱图对比确认。以人参皂苷Re（峰39）为例，在负离子模式下，显示其准分子离子m/z991.551 8 [M+HCOO]-和945.544 7 [MH]-其主要的特征碎片离子为m/z799.486 7[M-HRha]-、637.432 1[M-H-Rha-Glc]-、619.420 2[M-H-Rha-Glc-H2O]-、475.382 2 [M-H-Rha-2Glc]-等，是准分子离子峰失去1 分子鼠李糖和2 分子葡萄糖而产生，通过与对照品及相关文献[16-19]比对，鉴定为人参皂苷Re。

共鉴定了24种五环三萜及其苷类成分，此类化合物苷元部分上的基团特征多为C22位含有乙酰基，羟基或者鼠李糖，C30为多含有羧基，C3为多含葡萄糖醛酸、葡萄糖或者鼠李糖等，而C24的为少数含有羟基，其裂解规律为中性丢失AcOH、H2O、CH2O及HCOOH 等中性分子[20]。以甘草酸为例阐述三萜皂苷类成分的裂解规律。该化合物的正离子质谱中可以观察到m/z823.412 1 [M+H]+，负离子质谱中给出了m/z821.398 7 [M-H]-，综合分析确定了其分子式为C42H62O16。在正离子二级质谱的碎片峰中可以发现m/z645.370 2 [M-H-Glc A]-，469.327 4 [M-H-2Glc A]-，和351.056 7 [M-H-470 Da]-，确定结构中C3位连接2 个葡萄糖醛酸的结构，且470 Da 应该为苷元的相对分子质量。后又观察到803.410 4[M-H-H2O]-，627.358 6[M-H-Glc AH2O]-，和583.366 6[M-H-Glc A-H2O-CO2]-等碎片离子，结合文献报道[20-23]及与对照品对比，最后推测峰84为甘草酸。

3.2.4 甾体皂苷类化合物 甾体皂苷主要来源于方中的麦冬，共鉴定了7种甾体皂苷类化合物，是麦冬的特征性成分。该类化合物因分子结构中连有多个糖基和羟基，易发生丢失所连糖基或脱水的中性丢失。峰126 在正负离子模式下，分别显示了m/z855.464 8 [M+H]+和853.461 7 [M-H]-的准分子离子峰，利用软件分析其元素组成并推导其可能的分子式为C44H70O16。在正离子模式的二级质谱中，该母离子连续丢失糖基和脱水，形成m/z723.433 0[M+H-Xyl]+、577.375 4[M+H-Xyl-Rha]+、559.367 3[M+H-Xyl-Rha-H2O]+、431.316 5 [Aglycone+H]+、413.305 3 [Aglycone+H-H2O]+、287.200 7 [Agly‐cone+H-144]+，269.190 3 [Aglycone+H-144-H2O]+等的特征碎片离子，结合文献报道[22-27]及与对照品对比，最后推测峰126为麦冬皂苷D，其可能的裂解规律见图4。

图4 麦冬皂苷D的裂解规律Figure 4 The fragmentation pathway of Ophiopogonin D

3.2.5 苯丙素类化合物 通过UPLC-Q-Exactive MS数据分析，结合文献对比共识别了在7 种苯丙素类化合物，均来源于方中的法半夏、粳米、甘草和大枣。苯丙素类成分以异落叶松脂素-9'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为例。例如峰23 在正离子模式下保留时间为16.42 min 时为给出了m/z523.216 3[M+H]+的准分子离子，经软件计算的其分子式为C26H34O11，该母离子连续丢失糖基和脱水，形成二级碎片主要有m/z361.128 4 [M+H-Glc]+、343.118 4 [M+H-Glc-H2O]+和237.076 0[M+H-Glc-124 Da]+等。由于具有以上特征的裂解碎片峰，并与文献报道数据对比[28-30]，将峰23 鉴定为异落叶松脂素-9'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3.2.6 其他化合物 从麦门冬汤中还鉴别了一些其他的成分，包括芳香酸类、生物碱等类化合物，主要来源于法半夏、大枣、粳米和甘草[28-30]。芳香酸类成分在质谱中的裂解特征主要为丢失CO、CO2、H2O等中性分子。根据裂解规律并结合文献报道[28-29]，鉴定了麦门冬汤中的芳香酸类化合物。以峰4（原儿茶酸）为例，在二级质谱中，其准分子离子峰为[M-H]-m/z153.018 4，丢失一分子CO2，得到m/z109.028 3，准分子离子丢失一分子H2O，得到m/z135.007 6。类似的，其他芳香酸类和生物碱类化合物得到鉴定[28-30]。

4 讨论

中药复方成分复杂，根据各种成分的结构和性质，综合超声提取、索氏提取、加热回流提取等方法的优劣点，超声提取法简单、快速、高效，因此实验采用超声提取法对麦门冬汤进行处理。对提取溶剂（50%、75%、100%甲醇及水，50%、75%、100%乙醇及水）进行考察，结果表明75%甲醇提取所得到的化学成分信息最多，因此选择75%甲醇作为提取溶剂。本实验考察了甲醇-水体系和乙腈-水体系对麦门冬汤提取物的分离能力，发现乙腈和水体系表现出更好的分离和洗脱能力。对乙腈-水体系的水相pH 进行考察，分别考察0.01%甲酸、0.1%甲酸和0.2%甲酸，发现0.1%甲酸水可以防止峰的严重拖尾，最终确定乙腈-0.1%甲酸水体系。在此研究的基础上，优化麦门冬汤的质谱条件，通过考察不同裂解能量对麦门冬汤化学成分的影响，优化了最佳裂解条件，最终正负离子模式下均选择20 eV 作为碰撞能量。

古代经典名方是指疗效确切、应用广泛并具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂。目前麦门冬汤临床主要用于慢性萎缩性胃炎和慢性肺纤维化等呼吸道疾病患者，且疗效显著[1-2]。麦门冬汤由多味药组成，化学成分复杂。本研究采用UPLC-Q-Exactive MS 技术对麦门冬汤的化学成分进行快速分析和鉴别，采用正、负离子2种模式进行分析，首次从麦门冬汤中共鉴定出141个化学成分，包括黄酮及其苷类54 个、高异黄酮类27 个、三萜及其苷类40个、甾体皂苷类7个、苯丙素类7个和其他类6个。首次对经典名方麦门冬汤的化学成分进行了全成分分析，本研究结果进一步丰富了麦门冬汤的物质基础，系统阐明了麦门冬汤的化学组成，为进一步明确其质量控制和药效物质基础提供了参考。