“通督调神”法预针刺对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马组织血管新生的影响

周佳晓,高华嵩,刘 强,石 磊

(天津中医药大学第一附属医院 国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381)

血管性痴呆(Vascular dementia，VD)是一种与脑血管损伤直接相关的神经认知障碍，表现为注意力、信息处理、复杂活动困难以及思维和行为紊乱[1]。慢性低灌注和栓塞事件导致脑血流减少、缺氧、氧化应激并诱发炎症反应，使大脑皮质、海马体等重要脑组织极易受损进而造成以记忆和认知异常为特征的神经组织功能障碍。然而成年脑在病理状态下仍具有改变自身结构和功能的可塑性，而脑组织的血管新生则是血管系统重塑的重要方式[2]。针刺能促进受损脑组织的血管新生，并通过调节神经因子、改善局部血流等促进学习记忆功能恢复[3]。 “通督调神”针法是把握脑血管病病变进程关键节点与时间窗的病因病机演化规律所创立的针法，其精髓在于通督脉、调元神。脑血管病的病机多为神机逆乱，而督脉与脑有着密切联系，因而通督调神针法在临床实践中对于血管性痴呆等脑血管病的防治具有确切的疗效，但其物质基础和作用机制有待进一步探索。本研究通过针刺干预血管性痴呆大鼠观察其学习记忆能力，并从海马组织的血管新生情况和信号通路干预的角度来探讨“通督调神”针法预防血管性痴呆的作用机制，为针刺防治VD提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48只SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(200±10)g。由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供[生产许可证号：SCXK(京)2019-0010]。大鼠饲养于昼夜分明的动物房中，室温22～26 ℃，湿度50%～60%，环境适宜，通风良好，大鼠自由进食、饮水，适应性饲养1周。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 仪器 华佗牌针灸针(0.25 mm×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司);Morris水迷宫(上海梵碧智能科技有限公司);自动脱水机(科迪kd-ts3a);石蜡包埋机(科迪kd-bm);切片机(德国徕卡RM2235);孵育箱(博讯);离心机(北京离心机厂LDZ5-2型);移液器(德国EPPENDORF);显微镜(日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11);干燥箱(日本三洋MIR-153型);低温冰箱(日本三洋MDF-382E型);恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型);医用微波炉(浙江临安爱迪仪器厂YWY781B型);Powerpac Basic电泳仪(BIO-RAD USA);温控摇床(New Brunswich USA);酶标仪(BioTek USA)。

1.2.2 试剂 异氟烷(河北金达福药业有限公司);络合碘(山东利尔康医疗科技股份有限公司);硫酸庆大霉素(金克隆生物技术有限公司);盐酸氟桂利嗪胶囊(西安杨森制药有限公司，国药准字H10930003，5 mg);多聚甲醛固定液(武汉塞维尔生物科技有限公司);苏木素染液、伊红染液、DAPI染色液(北京索莱宝科技有限公司)，CD34、CD105抗体(Abcam公司);PE标记羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);山羊抗小鼠二抗(ZSGB-BIO公司);VEGF、Ang-2抗体(Abcam公司);通用内参抗体套装(Abbkine公司);RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和高灵敏ECL发光试剂盒(Sangonbio公司);彩虹180广谱蛋白Marker、Western blot 封闭液Ⅱ和SDS-PAGE上样缓冲液(Solarbio公司)。

1.3 分组与干预方法

将大鼠按随机数字表法随机分为正常组、模型组、西药组和针刺组各12只，每组再分7 d、14 d两个亚组各6只。

1.3.1 针刺组 在模型制备前采用“通督调神”针刺法连续干预7 d，均于每日上午同一时间进行1次。捆绑固定大鼠后，采用0.25 mm×25 mm 针灸针，“百会”向后平刺10 mm,“水沟”向鼻中隔方向斜刺2 mm,双侧“风池”向后下方斜刺5 mm,双侧“神门”直刺1 mm，采取平补平泻手法，留针20 min。穴位定位参考《实验动物针灸穴位图谱》[4]。

1.3.2 西药组 在模型制备前将盐酸氟桂利嗪药粉用生理盐水配成1 mg/mL混悬液，按1 mL/kg腹腔注射给药，连续干预7 d，均于每日上午同一时间进行1次。

1.3.3 模型组和空白组 仅于相同时间捆绑和固定，不予其他干预。模型组于7 d后和针刺组、西药组一同进行模型制备。

1.4 模型制备

采用双侧颈总动脉永久性结扎法复制大鼠VD 模型[5]：术前12 h禁食不禁水，2%异氟烷吸入麻醉后将大鼠四肢张开仰卧位固定于操作台，颈前区备皮暴露手术部位，碘伏消毒后用手术剪沿颈部正中剪开约1 cm切口，向下钝性分离暴露出颈总动脉，将其与迷走神经分离后以4-0号丝线双重永久性结扎，缝合切口，局部碘伏消毒并滴注庆大霉素0.2 mL预防感染。术后保暖，待大鼠自然清醒。

1.5 取材

各组7 d组于造模完成后第7天取材，迅速断头取脑，剥离海马组织，左侧大脑浸泡于10倍体积的4%多聚甲醛溶液中用于病理形态观察，右侧大脑分离海马组织后保存于-80 ℃液氮中用于分子生物学检测。各组14 d组于造模2周后Morris水迷宫行为学检测后立刻取材，取材及标本保存方法同7 d组一致。

1.6 观察指标及检测

1.6.1 Morris水迷宫行为学检测 14 d各组大鼠采用Morris水迷宫进行认知行为能力测试，实验共持续5 d，第1天为预实验，第2～4天进行定位航行实验：水温控制在23～28 ℃，按Ⅰ-Ⅲ-Ⅱ-Ⅳ象限顺序将大鼠面朝池壁放入水中，平台位置在第Ⅰ象限，记录大鼠从入水至找到平台并停留5 s所用的时间，即逃避潜伏期。计算4个象限测定结果的平均值，以第4天成绩作为最终平均逃避潜伏期。定位航行测试于每日固定时段训练4次，每次限时90 s，若超时计为90 s，并将大鼠引导至平台停留10 s以熟悉周围环境。第5天进行空间探索实验：撤除原平台，将大鼠从原平台象限的对侧象限，即第Ⅲ象限面朝池壁放入水中，记录90 s内大鼠在平台所在象限内活动的总路程。

1.6.2 海马组织HE染色 大鼠海马组织于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，按常规方法脱水、包埋处理，经苏木素染液、伊红染液染色，脱水干燥后中性树胶封固，制成5 μM左右厚度的切片用于镜下观察。

1.6.3 免疫荧光单染法检测CD34、CD105在大鼠海马组织内的表达 大鼠海马组织用4%多聚甲醛固定48 h后，经梯度乙醇脱水、二甲苯浸泡和石蜡包埋后制成 5 μM 的石蜡切片，将切片浸于二甲苯中1.5 h，经梯度乙醇(100%、95%和80%)刷洗后自来水冲洗；滴加山羊血清封闭液，室温20～30 min甩去多余液体，滴加第一抗体，4 ℃过夜，次日等拿出切片20 min室温平衡后放入PBS中；滴加PE标记羊抗兔抗体，37 ℃ 20 min后放入PBS中；用DAPI染色液染色10 min，自来水冲洗1次，去离子水冲洗1次；避光处将切片晾干，用防荧光淬灭剂进行封片。使用400倍荧光显微镜进行观察、拍摄，分别计数大鼠海马组织内CD34、CD105标记的微血管总数，分析结果。

1.6.4 Western Blot技术观察海马组织VEGF/Ang-2表达 取出样品组织，按每10 mg加入100 μL RAPI蛋白裂解液，置冰上剪碎研磨裂解20 min，12 000 r 4 ℃离心15 min，取上清；使用BCA法进行蛋白定量；根据SDS-PAGE上样量需要，取适量样品加入4×loading buffer后，100 ℃煮沸变性10 min。根据目的蛋白的分子量，配制10%分离胶凝胶，浓缩胶浓度为4%，待检测蛋白样品上样30 μg，浓缩胶恒压80 V约40 min，分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部；设置恒流350 mA，冰浴转膜2 h。将膜浸没在Western blot 封闭液Ⅱ中室温轻摇1 h；用TBST稀释一抗，β-actin鼠抗单克隆抗体稀释比例1∶1 000，其他抗体按产品说明书比例稀释，4 ℃过夜孵育；TBST洗膜3次，每次10 min；TBST稀释二抗，用羊抗鼠-HRP(1∶20 000)，羊抗兔-HRP(1∶20 000)室温孵育120 min；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL室温避光反应2 min，曝光扫描2 min。用Image J软件分析各条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 Morris水迷宫行为学测定结果

如表1所示，与正常组比较，模型组平均逃避潜伏期延长，平台区域总路程缩短，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，西药组、针刺组平均逃避潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.01)，平台区域总路程明显延长，差异具有统计学意义(P<0.01)；与西药组比较，针刺组平均逃避潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.01)，平台区域总路程延长，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠平均逃避潜伏期及平台区域总路程比较

2.2 大鼠海马组织病理形态比较

常规HE染色后，在光学显微镜下观察海马结构，正常组海马结构细胞排列整齐紧密，结构完整，细胞数目多，细胞核清晰可见; 模型组细胞结构排列稀疏紊乱，细胞数目较少且间隙变大，大部分细胞坏死，核仁形态模糊;针刺组和西药组大鼠海马神经元细胞较模型组有所改善，细胞排列较为整齐，疏松情况减轻，胞核形态基本正常，仅少量坏死神经元。与14 d各组比较，7 d组细胞数目更密集，排列更整齐，结构更清晰。见图1。

图1 各组大鼠海马组织病理形态改变情况(100×)

2.3 大鼠海马组织CD34、CD105阳性表达比较

与正常组比较，模型组CD34、CD105阳性表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比，西药组、针刺组CD34和CD105阳性表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)与西药组比较，针刺组CD34、CD105阳性表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2～3、表2～3。

注：蓝色标记为细胞核，绿色标记为CD34阳性表达。图2 各组CD34荧光单染图(400×)

注：蓝色标记为细胞核，绿色标记为CD105阳性表达。图3 各组CD105荧光单染图(400×)

表2 各组大鼠海马组织CD34阳性表达比较

表3 各组大鼠海马组织CD105阳性表达比较

2.4 大鼠海马组织VEGF/Ang-2蛋白表达比较

与正常组相比，7 d模型组大鼠海马组织VEGF、Ang-2蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，14 d模型组大鼠Ang-2蛋白表达增加明显，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，7 d针刺组、7 d西药组大鼠海马组织VEGF、Ang-2蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，而14 d仅针刺组大鼠海马组织VEGF、Ang-2蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，14 d西药组差异无统计学意义(P>0.05)；与西药组比较，7 d针刺组大鼠海马组织VEGF、Ang-2蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，14 d针刺组大鼠海马组织VEGF、Ang-2蛋白表达增多明显，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表4～5和图4。

表4 各组大鼠海马组织VEGF蛋白表达比较

表5 各组大鼠海马组织Ang-2蛋白表达比较

注：Aa针刺7 d组；Ba西药7 d组；Ca模型7 d组；Ab针刺14 d组；Bb西药14 d组；Cb模型14 d组；D正常组。图4 Western blot检测条带

3 讨论

血管新生是指在原有血管床基础上血管发芽，从已存在的血管系统中形成新血管的过程。在组织缺血缺氧、炎细胞浸润诱导及细胞因子等多因素的作用下，原组织微血管内皮细胞激活，合成释放如金属蛋白酶等可降解原血管基膜，使原有血管基膜部发生降解，血管通透性增加。在多种生长因子及趋化因子的作用下，内皮细胞穿过原血管壁发生迁移、增殖，形成芽生血管腔，新生血管芽相互融合形成血管网，趋化周围细胞进一步构建血管结构。

CD34是内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)表达特异性表面膜标志物， EPCs通过分泌血管活性因子、血管生成因子修复受损组织，促进内皮化和血管化，参与血管的发育和再生[6]。CD105又名内皮因子，是转化生长因子-β(Transfer growth factor-β，TGF-β)的受体蛋白，仅在增殖活跃的微血管内皮细胞中强表达，因此在标记新生血管方面具有较高的特异性[7]。造模后模型组CD34、CD105表达有所增加，表明脑卒中发生后正常脑组织会发生一定程度的代偿性血管新生，但经过针刺干预的脑组织中CD34、CD105表达量明显大量增多，提示“通督调神”针刺法具有显著的促血管新生作用。

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)作为高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，特异性作用于血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VECs)，促进血管内皮细胞分裂、增殖，VEGF与VEGFR-2(Vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)等对应受体结合，刺激新的内皮细胞分化、增生并形成管腔样结构，实现血管生成,提高血管通透性。同时，血管生成素(Angiopoietin，Ang)家族协同VEGF调节血管新生过程，其中，血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)主要由VECs产生，其受体Tie-2亦表达于VECs。Ang-2与Tie-2结合，使血管处于不稳定可塑状态，易受促血管生成因子刺激；同时，VECs活化时，Ang-2的释放增加，可诱发内皮细胞间隙增宽、通透性提高[8-9]。

迄今为止，尚无针对VD病理的干预药物应用于临床，盐酸氟桂利嗪是一种能够通过血脑屏障的钙通道阻滞剂，能够降低因缺血缺氧引起的脑组织损伤，还会通过对神经传导的影响营养保护神经进而改善学习、记忆能力[10]，然而盐酸氟桂利嗪作为预防用药在本研究中促血管新生的作用并不突出，而针刺优势更为显著。“通督调神”针法的精髓在于通调督脉、调理元神[11]。《针灸大成》曰:“病变在脑，首取督脉”，针对脑血管病脑神逆乱、气血失调和脏腑失衡的病机，通督调神法着重对于督脉穴位针刺。百会为督脉、足三阳经及肝经等多条经脉的交会所在，有统督诸阳的作用，而督脉循行入脑，与任脉相接，与冲脉同出一源，故针刺百会有调神益气、安神定志和醒脑开窍之功效；水沟为督脉与手足阳明经交会穴，具有醒神开窍的功效；风池穴可疏风通络、通阳祛邪。以上诸穴均位于头部，脑为元神之府，故针刺该处穴位可激发阳气，调理元神，从而联系全身，共奏通督宣阳、调神益气之功，再佐以心经原穴神门养心安神。以上诸穴合用，共奏通调督脉、调理元神之功效，使元神得复，气血得顺，脏腑得平。

“治未病”理念是中医特色的体现，预针刺则是实现“治未病”的手段。针灸治未病最早可追溯至《灵枢·逆顺》曰：“上工刺其未生者”，《素问·四气调神大论》曰：“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱。”《金匮要略》云:“适中经络，未流传脏腑，即医治之。”《诸病源候论》中称之为“逆针灸”，既有在发病之前采取预防措施预防疾病发生的含义，也包含发病之后再行针刺防止加重的意义。研究者认为VD早期防治具有可逆性，能够有效改善VD患者的认知功能，提高记忆和语言能力[12]。因此，笔者提倡在疾病早期及早干预，在脑卒中发生后积极采取措施预防血管性痴呆的发生发展，通过通督调神针刺法进行系统治疗，在一定程度上减轻病症的同时，也能够极大地减轻患者的家庭负担和社会经济负担。