五味子素通过调控FOXC1基因对结直肠癌细胞恶性生物学行为的作用机制

许亚坡 罗金键 夏 超 吴慧丽

全球范围内结直肠癌(colorectal cancer，CRC)每年新发病例数约180万，死亡人数约88万[1]，而近年我国CRC患病率及死亡率呈上升趋势，患病率居恶性肿瘤第三位，死亡率居第五位[2]，严重威胁国民生命健康。手术是治疗早期CRC的有效手段，但进展、转移等阶段的CRC患者，生存情况不容乐观，分子靶向机制是现阶段临床研究重点[3]，故而探寻有效的基因治疗靶点药物对患者生存有积极意义。五味子素来源于五味子中分离的木脂素类活性成分，具有抗炎、神经保护、调节细胞代谢等多种药理作用[4]，近年研究表明其在肿瘤抑制方面显示出确切效果[5]。另有研究发现，叉头框转录因子C1(Forkhead boxC1，FOXC1)作为插头框转录因子家族重要一员，与癌细胞分化、发育等过程密切相关，上调其水平可促进CRC癌细胞增殖[6]。但目前关于五味子素对CRC细胞增殖、侵袭及调控FOXC1基因的机制尚未明确，本研究以CRC HCT116细胞为研究对象，探讨五味子素对HCT116细胞的影响，并进一步分析其作用机制，为临床CRC治疗提供参考依据。报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人CRC HCT116细胞，购自上海匹拓生物科技有限公司。

1.1.2 试剂与仪器 RPMI-1640培养基购自上海微科生物技术有限公司，Opti-MEM培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购自上海泽叶生物科技有限公司，LipofectamineTM 2000试剂盒及Trizol溶液来自北京索莱宝科技有限公司，Transwell chamber购自广州赛哲科技有限公司；五味子素、DEPC购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司，Binding Buffer缓冲液购自上海君瑞生物技术有限公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)购自北京冬歌博业生物科技有限公司，碘化丙啶(PI)及0.1%结晶紫购自上海麦克林生化科技有限公司，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)购自上海群己生物科技有限公司；FOXC1、FOXC1-NC(模拟物阴性对照)均购自美国Sigma-aldrich公司；FOXC1(ab227977)、E-cadherin(ab16663)、MMP2(ab92536)、Vimentin(ab92547)抗体购自美国Abcam公司；Varioskan LUX型酶标仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，流式细胞仪(美国BD公司，FACSCalibur型)，Avanti J-E离心机购自美国贝克曼库尔特有限公司，Powerpac Universal型电泳仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人CRC HCT116细胞，生长于含10%灭活胎牛血清、100 U/ml链霉素及青霉素的RPMI-1640培养基，将培养基置于5% CO2、37 ℃的饱和温度培养箱中，每2～3 d使用0.25%胰蛋白酶消化及传代细胞1次，采用10% DMSO+90%血清冻存液来冻存细胞，用于后续实验操作。

1.2.2 CCK-8检测CRC HCT116细胞增殖 取对数生长期HCT116细胞，接种于96孔板(每孔2×104个)，分别添加0、12.5、25、50 μmol/L浓度的五味子素(甲醇溶解)，每个浓度设置5个复孔，将HCT116细胞在培养箱(5% CO2、37%)中分别培养12 h、24 h、48 h，细胞贴壁丢弃培养基，再添加10 μl CCK-8与200 μl培养基，37 ℃孵育2 h，490 nm波长下使用酶标仪测定吸光度值，计算不同浓度下细胞存活率，明确细胞增殖情况，重复3次，取平均值。并选择细胞存活率接近50%的五味子素浓度进行后续实验研究。

1.2.3 细胞转染与分组 随机分层法分为5组：对照组、FOXC1-NC组、FOXC1组、五味子素组、FOXC1+五味子素组。转染前24 h，取长势良好对数生长期HCT116细胞，倒置显微镜，观察细胞增殖至60%～70%时，进行胰蛋白酶消化，收集CRC HCT116细胞，PBS重悬，调整细胞密度，以1×106个/ml接种到24孔板，每组设置5个复孔，每个复孔重复3次，之后进行细胞转染：使用相关基因序列质粒(2.4 μl的FOXC1-NC及FOXC1)与5 μl的LipofectamineTM2000分别添加至245 μl的Opti-MEM培养基中，制成溶液备用，静置5 min后，混匀，静置30 min，37 ℃继续培养(48 h)，荧光显微镜下观察转染率，转染成功标准为转染率>85%，以便用于后续实验。对照组不做任何处理，FOXC1-NC组转染FOXC1-NC，FOXC1组转染FOXC1，五味子素组HCT116细胞内加入50 μmol/L五味子素，FOXC1+五味子素组稳定转染FOXC1 24 h后加入五味子素50 μmol/L。

1.2.4 流式细胞仪测定HCT116细胞凋亡情况 取HCT116细胞，添加预冷PBS缓冲液，离心6 min(4 ℃，1000 r/min，离心半径10 cm)，弃上清液，再次加入预冷PBS缓冲液，离心(离心条件同上)，弃上清液，加入500 μl 1×Binding Buffer缓冲液来重悬细胞，之后依次加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI，室温下振荡孵育，使用流式细胞仪测定细胞凋亡情况，CELL QUEST 3.0分析实验数据。

1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭能力 预冷培养液，以1∶8比例稀释Matrigel基质胶与培养基，加入Transwell chamber上室(40 μl/孔)，培养箱孵育(37 ℃，5 h)，选取对数期HCT116细胞，加入Transwell chamber上室，每孔3×104个，将100 g/L胎牛血清培养液加入Transwell chamber下室，每孔600 μl，培养箱培养24 h(37 ℃)，PBS缓冲液洗涤，棉签擦去微孔膜内层磁暴，多聚甲醛固定(20 min)，PBS清洗，0.1%结晶紫染色(10 min)，洗去表面结晶紫，选10个视野，显微镜下计算侵袭至微孔膜下层的细胞数，重复3次实验，取平均数。

1.2.6 Realtime-PCR测定FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表达 收集各组培养48 h的HCT116细胞，PBS缓冲液冲洗2次，吸尽PBS溶液后，予以Trizol溶液1 ml震荡混匀(4 ℃，5 min)，加入0.2 ml氯仿振荡15 s，静置(4 ℃，3 min)，离心(4 ℃，12000 rpm，15 min)，取上层水相至离心管，加入等体积异丙醇，-20 ℃静置20 min，离心(4 ℃，12000 rpm，15 min)，弃上清，1 ml DEPC处理后洗涤沉淀，离心机离心(4 ℃，8000 rpm，185 min)，加入dd H2O水30 μl，溶解RNA；RNA逆转录合成cDNA，以逆转录cDNA为模板，进行PCR扩增，引物序列如表1，反应体系如下：总反应体系10 μl，2 μL模板cDNA ，各1 μl上下游引物，扩增条件(98 ℃反应5 min，95 ℃变性15 s，72 ℃延伸30 s，熔解曲线55 ℃～95 ℃，40个循环)；以β-actin为内参，目的基因相对定量采用2-△△CT法计算。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot检测FOXC1、MMP2、E-cadherin、Vimentin蛋白表达 取各组细胞，加入蛋白裂解液，混匀，充分裂解20～30 min，提取蛋白质，之后予以离心(12000 r/min，离心半径10 cm，5 min)，取上清液，SDS-PAGE电泳，电转缓冲液转膜(50 min)，转移蛋白至硝酸纤维素膜上，将其放入50 g/L脱脂奶粉中，孵育2 h，TBST洗膜5 min，在加入稀释(1∶1000)的FOXC1、MMP2、E-cadherin、Vimentin一抗与稀释(1∶2000)的β-actin一抗中孵育过夜(4 ℃)，次日洗膜，加入稀释(1∶2000)二抗孵育(室温，1 h)，洗膜，暗室中曝光显影，凝胶成像系统扫描，Image J 软件分析灰度值，计算相对表达量：目的蛋白/内参β-actin灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度五味子素对HCT116细胞存活率的影响

使用不同浓度五味子素作用于HCT116细胞，检测不同时间点细胞存活率，结果发现，与0 μmol/L五味子素处理HCT116细胞比较，在12 h、24 h、48 h时采用12.5、25、50 μmol/L五味子素处理的细胞存活率逐渐降低(P<0.05)，其中采用50 μmol/L五味子素处理48 h时，细胞存活率最接近50%，后续实验均选取此条件细胞。见图1。

图1 不同浓度五味子素处理不同时间的HCT116细胞存活率

2.2 各组细胞凋亡率比较

5组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较结果显示，与对照组、FOXC1-NC组比较，FOXC1组细胞凋亡率降低(P<0.05)；与对照组比较，五味子素组细胞凋亡率升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素组细胞凋亡率高于FOXC1组，低于五味子素组(P<0.05)。见表2。

表2 各组HCT116细胞凋亡率比较

2.3 各组细胞侵袭能力比较

5组侵袭细胞数比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组、FOXC1-NC组比较，FOXC1组侵袭细胞数升高(P<0.05)；与对照组比较，五味子素组侵袭细胞数下降(P<0.05)；且FOXC1+五味子素组侵袭细胞数低于FOXC1组，高于五味子素组(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组HCT116细胞侵袭细胞数比较

2.4 FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表达水平

5组HCT116细胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组、FOXC1-NC组比较，FOXC1组FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表达水平升高，E-cad-herin mRNA表达水平下降(P<0.05)；与对照组比较，五味子素组FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表达水平降低，E-cadherin mRNA表达水平升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素组FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表达水平低于FOXC1组，高于五味子素组，且E-cadherin mRNA表达水平高于FOXC1组，低于五味子素组(P<0.05)。见表4。

表4 各组HCT116细胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表达水平

注：×200，A：对照组；B：FOXC1-NC组；C：FOXC1组；D：五味子素组；E：FOXC1+五味子素组

2.5 FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin蛋白表达水平

5组HCT116细胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin 蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组、FOXC1-NC组比较，FOXC1组FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表达水平升高，E-cadherin蛋白表达水平下降(P<0.05)；与对照组比较，五味子素组FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素组FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表达水平低于FOXC1组，高于五味子素组，且E-cadherin蛋白表达水平高于FOXC1组，低于五味子素组(P<0.05)。见表5、图3。

表5 各组HCT116细胞FOXC1、MMP2、Vimentin、E-cadherin蛋白表达水平

3 讨论

目前研究认为CRC是环境、遗传、饮食习惯、生活方式等多因素协同作用的结果，mi RNA基因突变或扩增，致使致癌信号激活，细胞发生恶变，产生大量利于自身生长的趋化因子，不加干预会不断恶化、转移，手术、化疗虽可延长患者生存时间，但手术存在肿瘤分期限制，化疗存在耐药性及毒副作用，整体生存率仍有待提高[7]，因此深入探索其他CRC治疗机制十分必要。

注：A：对照组；B：FOXC1-NC组；C：FOXC1组；D：五味子素组；E：FOXC1+五味子素组

五味子素来源于木兰科植物五味子，前期学者研究发现其具有广泛的生物活性，如有学者[8]发现，五味子素B可转导TLR4信号，减少神经元凋亡，以保护神经；另有学者发现[9]五味子素B可增强多西他赛的抗肿瘤作用，促进细胞凋亡。随着临床的应用逐渐发现，五味子素系列在肿瘤方面显示出独特优势，研究表明[10]五味子素A可下调miR-155水平，抑制乳腺癌细胞增殖，且有研究发现[11]五味子素B能诱导人前列腺癌细胞凋亡，具有潜在药理作用。而五味子素对CRC细胞的凋亡、侵袭能力影响尚不清楚。本研究采用不同浓度五味子素处理CRC HCT116细胞发现，不同浓度五味子素可不同程度降低细胞存活率，提示五味子素可降低HCT116细胞活性。为进一步评估五味子素对各组HCT116细胞的凋亡、侵袭影响，本研究采用流式细胞仪测定HCT116细胞凋亡情况，Transwell实验测定细胞侵袭能力，结果显示，经转染FOXC1后，细胞凋亡率低于对照组、FOXC1-NC组，侵袭细胞数高于对照组、FOXC1-NC组，提示过表达FOXC1可抑制细胞凋亡，增强细胞侵袭力；在过表达FOXC1后使用五味子素干预，发现FOXC1+五味子素组细胞凋亡率低于五味子素组，而侵袭细胞数高于五味子素组，提示五味子素抑制促进细胞凋亡及抑制细胞侵袭，可能与降低FOXC1表达有关。

FOXC1定位于染色体6p25上，是FOX家族重要一员，已被证实在肝癌、肺腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，参与癌细胞生物学行为，与细胞迁移、侵袭、耐药性密切相关[12-14]。Seong-Hoon Yun等[15]国外学者发现，OUP-TFII敲低可上调FOXC1表达，促进大肠癌细胞增殖与侵袭；而刘健等[16]学者研究显示，FOXC1可直接与靶基因整联蛋白α7、成纤维细胞生长因子受体4结合，激活其表达，促进直肠癌转移。上述表述提示FOXC1与CRC发展进程相关，本研究进一步进行Realtime-PCR及Western blot检测，分析各组细胞FOXC1及其下游基因mRNA、蛋白表达变化，结果发现，FOXC1组FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA及蛋白表达水平高于对照组、FOXC1-NC组，E-cadherin mRNA及蛋白表达水平低于对照组、FOXC1-NC组，而五味子素组上述表达水平相反，而FOXC1+五味子素组则可部分逆转五味子素对FOXC1及其下游E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA及蛋白表达水平，以此验证五味子素可下调FOXC1表达，调节相关mRNA、蛋白水平，进而抑制细胞侵袭能力，促进HCT116细胞凋亡。

综上，FOXC1在CRC HCT116细胞中高表达，促进细胞增殖，而五味子素可降低细胞活力，抑制其侵袭，可能与五味子素下调FOXC1表达及调节相关mRNA、蛋白表达有关，可为临床基因靶向治疗提供实验依据，但本研究尚存一定局限性，需动物体实验来验证上述结论。