Tiam1蛋白表达介导PI3K/Akt/mTOR信号通路对老年胰腺癌细胞转移、侵袭的影响

尚娜娜 董雪茹 刘 志

胰腺癌是一类病因多且复杂、发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，据报道该类患者5年生存率小于5%[1]。有学者通过研究发现，T淋巴瘤侵袭转移诱导基因(T Lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1,Tiam1)蛋白作为一类高保守、高敏感基因，可通过HCG/c-MET信号通路而特异性调节乳腺癌细胞侵袭和转移[2]。而Tiam1在非小细胞肺癌、肾癌等多种恶性肿瘤中均有表达[3-4]，考虑Tiam1蛋白可能介导PI3K/Akt/mTOR信号通路调控胰腺癌细胞转移、侵袭等生物学行为。但参阅国内外研究文献，发现关于 Tiam1蛋白、PI3K/Akt/mTOR信号通路在胰腺癌中作用机制的报道较少，因此本研究就此展开报道，以期深入分析胰腺癌转移、浸润相关机制及治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织及细胞 收集2017年1月至2019年12月本院手术切除的胰腺癌组织及癌旁组织各106例，术中将组织置于液氨冷冻后放入-80 ℃保存。人胰腺癌细胞株SW1990购自上海通派生物科技有限公司。

1.1.2 慢病毒转染 收集处于生长对数期的人胰腺癌SW1990细胞接种于6孔板，每孔5×104个；培养液用含10% FBS的DMEM，培养箱条件：37 ℃ 5% CO2。待细胞爬满孔板80%左右，吸出培养液并采用PBS清洗，加入无血清DMEM培养24 h，采用LipofectAMINE 2000转染试剂盒将携带慢病毒的质粒转染入细胞体内，培养72 h，荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞占比超过80%为转染成功。

1.1.3 HGF溶液制备 粉末状HGF用二甲亚飒(DMSO)溶解配置成含HGF 50 mg/mL的溶液，倒入EP管，置于-80 ℃保存，使用时按需用DMEM进行稀释。

1.1.4 试剂与仪器 试剂：RIPA蛋白裂解液(北京雷根生物技术有限公司)，FBS、DMEM(北京沃比森科技有限公司)，BCA试剂盒(上海岚派生物科技有限公司)，ECL发光试剂盒(上海乔羽生物科技有限公司)，LipofectAMINE 2000转染说明书(美国赛默飞)，空白Tiam1质粒pGenesill-shRNA、Tiam1质粒pMag-3x-iRFP(武汉巴菲尔生物技术服务有限公司)，DMSO(美国Promega公司)，PBS缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)，CCK-8试剂盒(上海酶联免疫生物有限公司)，Transwell小室(广州维德昕生物科技有限公司)，4% HCHO(山东淄博齐星化学科技有限公司)。仪器：倒置荧光显微镜(德国徕卡DMi8型)、CO2培养箱(上海航佩仪器有限公司WJ-Ⅱ型)、PCR仪(广州鼎国生物技术有限公司)、MR-100酶标仪(山东博冠生物技术有限公司BK-EL10C)。

1.2 方法

1.2.1 Western Blot法检测Tiam1、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达量 取细胞用PBS溶液冲洗，加蛋白裂解液处理30 min，在4 ℃条件下以12000 rpm离心15 min，取上清液测定蛋白质浓度，合格后取总蛋白上样进行电泳，以β-actin为内参，获取的蛋白条采用软件计算待测蛋白的相对表达量。

1.2.2 CCK8法检测细胞增殖 取生长对数期SW1990细胞制成悬液后接种于96孔板，每孔约2×103个，采用浓度为50 ng/mL的HGF溶液和生理盐水处理并作为HGF组和空白组，转染Tiam1 minic作为Tiam1组；在显微镜下观察到贴壁生长后分别加入10 μL CCK8，并在5% CO2、37 ℃条件下培养；分别在0、12、24、48、60 h时采用酶标仪测定两组溶液在450 nm处的光密度(optical density, OD)值，计算HGF对胰腺癌增殖作用，细胞增殖率=(研究组细胞OD/空白组细胞OD)×100%。分别于0 h,12 h,24 h,48 h,60 h时计算Tiam1蛋白对过表达HGF胰腺癌细胞增殖作用。

1.2.3 Transwell小室实验 取单细胞悬液接种于96孔板中，每孔约2×103个，分为空白组、HGF组、Tiam1组。于Transwell小室上、下室中分别加入60 μL基质胶、含10% FBS的DMEM培养液，培养24 h后弃上室液体，4% HCHO固定15 min，然后进行HE染色，观察并计算穿过小室膜的细胞数，重复测定3次。

1.2.4 划痕实验 取上述实验中3组细胞用胰酶消化，吹打成2×108个/L悬液并接种于48孔板，待细胞爬满孔板80%左右，用移液枪头垂直方向划痕，继续培养24 h，观察并计算细胞迁移距离。

1.3 统计学处理

应用SPSS 18.0软件进行统计分析，符合正态分布的连续变量以均数±标准差，两组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较采用Snk-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 胰腺癌组和癌旁正常组细胞Tiam1表达情况分析

Tiam1在胰腺癌组织中呈高表达，在癌旁正常组织中呈低表达(图1)。胰腺癌组和癌旁正常组细胞Tiam1表达量分别为(4.11±0.40)、(1.98±0.29)，胰腺癌组织中Tiam1表达量高于癌旁正常组织中Tiam1表达量(P<0.05)。

图1 胰腺癌组和癌旁正常组细胞Tiam1表达图(Western Blot法)

2.2 三组胰腺癌细胞增殖率分析

各组在转染0 h、12 h时细胞增殖率比较无明显差异(P>0.05)。转染24 h、48 h、60 h时，与空白组比较，Tiam1组和HGF组细胞增殖率升高，且Tiam1组高于HGF组(P<0.05)(图2)。

注：*为与空白组比较，P<0.05；#为与HGF组比较，P<0.05。

2.3 三组细胞侵袭能力

Tiam1组穿过小室细胞数较多，经过HE染色后染色细胞较其他两组更明显；空白组、HGF组穿膜细胞数更少，且HGF组低于空白组(P<0.05)，见图3。

注：*为与空白组比较，P<0.05；#为与HGF组比较，P<0.05。

2.4 三组细胞转移能力分析

与空白组比较，Tiam1组和HGF组转移能力增强，且Tiam1组高于HGF组(P<0.05)(图4)。

图4 空白组、HGF组和Tiam1组细胞转移能力(×100)

2.5 Tiam1蛋白介导HGF激活PI3K-Akt-mTOR信号通路

与空白组比较，Tiam1组和HGF组Tiam1、PI3K、Akt、HGF表达均增强，且Tiam1组Tiam1、PI3K、Akt、HGF表达量高于HGF组(P<0.05)(图5)。

图5 3组细胞PI3K-Akt-mTOR相关蛋白表达图

3 讨论

通过靶向免疫系统、肿瘤微环境及肿瘤基质等抑制相关细胞受体，调节胰腺癌发生细胞数为目前胰腺癌治疗新领域。Tiam1蛋白在大多数正常组织中呈低表达或不表达状态，目前已经发现其在多种恶性肿瘤细胞中表达上调：有研究显示Tiam1在宫颈癌组织中表达上调，细胞实验也发现高表达Tiam1组癌细胞侵袭能力更高、生存率低；翁丹丹等[5]指出高表达Tiam1可抑制肝癌细胞增殖、迁移过程；张瑶等[6]的报道显示，Tiam1在非小细胞肺癌细胞中表达上调，且与肿瘤恶性程度密切相关，可调节肿瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用。本文胰腺癌组织中Tiam1表达量高于癌旁正常组织，说明Tiam1表达可促进胰腺上皮肿瘤发生。既往研究报道显示，随着肺癌TNM分期及分级提高，Tiam1表达量逐渐增高，说明Tiam1表达可能促进癌症进展[7]。本研究中Tiam1蛋白主要定位于细胞质和细胞膜，呈片状或弥漫不均一分布,参考Liu等[8]的文献结果，考虑Tiam1定位可能与肿瘤细胞侵袭、转移有关。Tiam1调控胰腺癌疾病进展途径不容忽视，可就此探讨miRNAs干扰技术对肿瘤进行治疗的可能。本次结果显示，转染组穿过小室膜的细胞数、细胞迁移水平更高，提示Tiam1可促进胰腺癌细胞侵袭、转移能力提高。

Tiam1蛋白可特异性结合激素和神经递质而激发一系列生理反应，参考Feng等[9]发现Tiam1蛋白通过相关信号通路增强人骨肉瘤组织增殖、侵袭能力。研究显示PI3K/Akt/mTOR信号通路在细胞多种生物学行为中发挥着重要作用，主要机制为与包膜上HGF因子及其受体结合而发挥促进细胞黏附和癌细胞增殖[10]。当病原体感染机体后，Tiam1蛋白可被大量激活而促进HGF分泌，大量HGF进入细胞核参与激活HGF/c-MET转录过程，从而提高多种促细胞增殖、转移及周期调控蛋白表达进而增强癌细胞进展[11]。综合考虑，Tiam1蛋白是否为参与HGF/c-MET信号通路活化关键蛋白，进而调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，影响胰腺癌细胞增殖、转移、侵袭行为。本文胰腺癌细胞经HGF诱导后，生长曲线图显示出过表达HGF可有效增强癌细胞生长增殖，且该作用机制存在时间-剂量依赖性[12]，HGF特异性结合活化c-MET参与促进血管瘤发生发展，继而激活下游多种信号通路。进一步探讨HGF激活PI3K/Akt/mTOR信号通路机制发现，Tiam1蛋白过表达时，HGF诱导的PI3K/Akt/mTOR信号通路被阻断，提示Tiam1蛋白在胰腺癌细胞中参与介导HGF诱导胰腺癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路活化。

综上所述，Tiam1蛋白在胰腺癌中呈高表达，主要通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路而增强癌细胞增殖、侵袭、转移能力，有望成为胰腺癌治疗的新靶点。