基于Fe3O4@SiO2@NH2@C60的磁固相萃取/气相色谱－质谱联用检测中药材中多环芳烃

宋中荣，周 翔*，蒋青香，严志宏，蔡 瑛，李 慧*

（1.江西中医药大学 药学院，江西 南昌 330004；2.中国中医科学院中医药健康产业研究所，江西 南昌 330029）

中药作为我国医药的重要组成部分，在疾病的预防、诊断、治疗等方面发挥着重要作用。中药材是中药及相关产品的源头，其有效性和安全性将直接影响中药产品的质量。中药外源污染物是影响中药材质量的关键因素之一，已成为中药走向国际贸易的重要技术壁垒［1］。

多环芳烃（PAHs）是中药材的主要外源污染物之一，具有致癌、致畸、致突变效应［2］，可造成神经系统损伤、呼吸系统破坏等危害［3－5］，受到世界各国的广泛关注。美国国家环境保护局将萘、菲、芘、苯并［g，h，i］芘等16种PAHs列为优先控制污染物，我国也将萘、荧蒽、苯并［g，h，i］芘等7种PAHs列入环境污染黑名单［6］。PAHs是一种持久性有机污染物，易远距离迁移，广泛存在于空气、土壤和水中，并可能通过各种途径进入中药饮片［6－7］。如植物类中药材在生长过程中可能吸收来自自然环境中的PAHs；此外，饮片的高温炒制、蒸制、熏制等炮制过程中也可能产生PAHs［6］。根据文献报道，葛根、桔梗、番泻叶、连翘、杜仲、柴胡、决明子等中药材中均存在一定量的PAHs污染物［8－12］。

目前，检测PAHs常用的样品前处理方法主要有固相萃取［9，12－14］、固相微萃取［8］、QuEChERS［15］、浊点萃取［16］和凝胶渗透色谱［10，17］等。但上述方法存在繁琐、耗时、有机溶剂用量大等不足，而PAHs在中药材中仅痕量存在，且复杂的中药材样品基质容易对检测结果造成干扰，净化效果不佳时会严重影响目标物的测定准确度和重复性。因此，需要建立一种简单、选择性强、检出限低的前处理方法来富集中药材样品中的PAHs。

磁固相萃取（MSPE）是一种以磁纳米粒子（MNPs）作吸附剂，通过外加磁场使MNPs与基质分离的固相萃取技术，是一种新型的样品前处理技术，已广泛应用于分离富集复杂基质中的痕量目标物［18－20］。MNPs作为MSPE技术的核心，具有比表面积大、表面易功能化、易于操控和再生等优点，通过使用不同基团对其表面进行修饰，可使MNPs与目标物通过氢键、π－π键等作用力进行连接，从而选择性吸附目标物。C60又称为足球烯、富勒烯，作为碳的同素异形体，具有足球状结构，其特殊结构可使大量的共轭π电子云分布在其内外表面上［21－22］，使得C60可与芳香族类化合物以及含有不饱和键类化合物通过π－π键结合，已广泛应用于污染物的处理［23－26］。

本文以水合热法合成的Fe3O4@SiO2@NH2@C60为吸附剂，建立了一种易操作、灵敏度高、准确性好、能有效降低中药材样品中复杂基质对PAHs目标物干扰的磁固相萃取/气相色谱－质谱联用（MSPE/GC－MS）检测方法。以根、叶、果实入药的7种典型中药材（葛根、玄参、桑椹、栀子、桔梗、牡丹皮、淫羊藿）为研究对象，采用该方法探究了中药材中PAHs的污染情况，以期为进一步完善中药材的质量控制提供借鉴。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

玄参、栀子、桔梗、牡丹皮、淫羊藿（批号分别为2104002、2104002、2111001、2109001、2108001）购于安国市昌达中药饮片有限公司；葛根、桑椹（批号分别为211108、20211207－1）购于南昌昌盛大药房。

C60（99.9%）、三乙胺（99.0%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，99%）购于上海易恩化学技术有限公司（罗恩试剂）。正硅酸乙酯（TEOS，98%）购于上海麦克林生化科技股份有限公司。FeCl3·6H2O（99%）、FeSO4·7H2O（99%）、氨水（26.5%）、异丙醇（99.7%）、无水乙醇（99.7%）、二氯甲烷（99.5%）、色谱级甲醇（99.9%）、色谱级正己烷（95%）、无水硫酸钠（99%）购于西陇科学股份有限公司。甲苯（99.5%）、水合肼（80%）、丙酮（99.5%）购于国药集团化学试剂有限公司。

16种PAHs混合标准溶液（2 000 mg/L，≥ 96%，溶于苯－二氯甲烷（体积比1∶1））购于Sigma－Aldrich有限公司，包括萘（Nap）、苊烯（Aceny）、苊（Acen）、芴（Flu）、菲（Phen）、蒽（Ant）、荧蒽（Fluo）、芘（Pyr）、苯并［a］蒽（B［a］A）、䓛（Chr）、苯并［b］荧蒽（B［b］F）、苯并［k］荧蒽（B［k］F）、苯并［a］芘（B［a］P）、茚并［1，2，3-cd］芘（I［1，2，3-cd］P）、二苯并［a，h］蒽（DB［a，h］A）、苯并［g，h，i］芘（B［g，h，i］P）。5种PAHs同位素内标混合溶液（2 000 mg/L，≥ 98%，溶于二氯甲烷）购于上海安谱实验室技术有限公司，包括萘－D8（Nap－D8）、苊烯－D10（Acen－D10）、菲－D10（Phen－D10）、䓛－D12（Chr－D12）和苝－D12（Per－D12）。

1.2 仪器与设备

8860型气相色谱仪、5977B型质谱检测器（美国Agilent科技有限公司）；IS5型傅里叶变换红外光谱仪（FT－IR，美国Thermo Fisher Scientific有限公司）；SU8010型扫描电子显微镜（SEM，日本Hitachi有限公司）；7404型振动样品磁强计（VSM，美国Lake Shore公司）；RCT－B－S025型磁力搅拌器（德国IKA仪器设备有限公司）；C－15R型高速离心机（德国纳赫特有限公司）；KQ－500B型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；Vortex－M型涡旋仪（上海沪析实业有限公司）；DZF－6020型真空干燥箱（宁国沙鹰科学仪器有限公司）；MS105DU型十万分之一电子天平（梅特勒托利多中国科技有限公司）。

1.3 Fe3O4@SiO2@NH2@C60 MNPs的合成［27－28］

采用水热法合成Fe3O4MNPs：取4.0 g FeCl3·6H2O，加入30 mL超纯水溶解，再加入2 mL水合肼和10.9 g FeSO4·7H2O，800 r/min强烈搅拌下加入氨水至溶液pH值为9。室温下400 r/min搅拌30 min，80 ℃下搅拌1 h，冷却后使用磁铁收集，水洗3次，60 ℃真空干燥12 h，得Fe3O4MNPs。

取1 g Fe3O4MNPs分散于100 mL异丙醇和8 mL超纯水的混合物中，氮气保护，超声15 min，依次加入10 mL氨水和8 mL TEOS，45 ℃下400 r/min搅拌12 h。使用磁铁收集，分别用水和乙醇洗涤3次，60 ℃真空干燥12 h，得Fe3O4@SiO2MNPs。

取1 g Fe3O4@SiO2MNPs分散于100 mL甲苯中，在N2气氛下，超声处理30 min。加入1 mL三乙胺和2 mL APTES后，将溶液加热至110 ℃，以400 r/min继续搅拌反应24 h，合成氨基改性产物。分别用水和乙醇洗涤3次，60 ℃下真空干燥，得Fe3O4@SiO2@NH2MNPs。

取2 g Fe3O4@SiO2@NH2MNPs溶于80 mL甲苯中，在N2气氛下，超声处理20 min。加入1 mL三乙胺，400 r/min搅拌30 min后，添加1 g C60。将混合物溶液加热至110 ℃，于400 r/min下反应12 h。分别用水和乙醇洗涤3次，60 ℃下真空干燥，得Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs。

1.4 标准溶液的配制

使用正己烷将16种PAHs混合标准溶液和5种PAHs同位素内标混合溶液分别稀释至质量浓度均为2 000 µg/L的PAHs标准储备溶液和PAHs同位素内标储备溶液，于−4 ℃下保存备用。

1.5 中药材样品处理

称取2.0 g中药材粉末（过4号筛），添加100 µL同位素内标物。加入20 mL二氯甲烷超声20 min，重复2次，合并提取液，在4 ℃下以5 000 r/min离心5 min，收集滤液，氮吹浓缩至近干。向残留物中添加10 mg Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs以及10 mL超纯水，用涡旋仪将混合溶液涡旋4 min，以吸附PAHs。涡旋完成后使用强磁铁收集MNPs，倾去上清液。添加2 mL正己烷，用涡旋仪将混合溶液涡旋2 min，使PAHs从Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs上洗脱下来，收集洗脱液并加入适量的无水硫酸钠静置片刻，吸取洗脱液中的水分。最后，将洗脱液用0.22 µm有机滤膜（尼龙）过滤后，转移至样品瓶中进行GC－MS分析。

1.6 色谱－质谱条件

色谱条件：HP－5 MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm，美国Agilent科技有限公司）进行色谱分离。采用高纯度氦气（纯度≥ 99.999%）作为载气，流速为1 mL/min。进样口温度为280 ℃，采用不分流进样模式，进样体积为1 µL。升温程序为：初始80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至180 ℃，以3 ℃/min升至200 ℃，然后以6 ℃/min升至250 ℃并保持3 min，最后以3 ℃/min升至300 ℃并保持6 min。

质谱条件：质谱仪电离模式为70 eV下的电子电离（EI）。四极杆温度为150 ℃，离子源温度为230 ℃，MS传输线温度为280 ℃，溶剂延迟3.5 min。采用离子监测（SIM）模式对数据进行采集，16种PAHs的保留时间、特征碎片离子和定量内标物（ISTD）见表1。

表1 16种PAHs及定量内标物的保留时间、定量离子与定性离子Table 1 Retention times，quantitative ions，qualitative ions of 16 PAHs and quantitative internal standards

1.7 数据处理

Agilent MassHunter Workstation（10.2.733.8）用于数据采集。使用Excel 2019对16种PAHs进行统计分析，计算数据均值、误差、回收率、相对标准偏差（RSD）；使用GraphPad Prism8.4.0制图；使用SPSS 21.0进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 磁纳米粒子表征

Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2和Fe3O4@SiO2@NH2@C60的FT－IR光谱如图1所示。Fe3O4MNPs在500 ~ 600 cm−1处显示出Fe—O的拉伸振动峰［29］；经SiO2改性后，在1 100 ~ 1 200 cm−1处出现1个新的强大的宽峰，此峰属于Si—O—Si拉伸振动峰［30］；Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs在524、578、1 180、1 427 cm−1处显示4个弱峰，与C60所显示的吸收峰一一对应，表明C60已被修饰到Fe3O4MNPs表面。

图1 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2和Fe3O4@SiO2@NH2@C60的FT－IR光谱Fig.1 FT－IR spectra of Fe3O4，Fe3O4@SiO2，Fe3O4@SiO2@NH2 and Fe3O4@SiO2@NH2@C60

使用SEM对磁纳米粒子的形貌进行研究。图2A ~ 2D表明，Fe3O4MNPs随着进一步的硅烷化、氨基化以及C60的功能化，所有MNPs尺寸在50 ~ 1 000 nm范围内逐步增大。图2D能够明显看出被C60功能化的MNPs形成了许多树枝状突起，这些突起能使其与目标物更充分接触，从而有效吸附PAHs。

图2 Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2（B）、Fe3O4@SiO2@NH2（C）与Fe3O4@SiO2@NH2@C60（D）的扫描电镜图Fig.2 SEM images of Fe3O4（A），Fe3O4@SiO2（B），Fe3O4@SiO2@NH2（C） and Fe3O4@SiO2@NH2@C60（D）

通过VSM测定了磁纳米粒子的磁力曲线，结果如图3所示。所有MNPs的磁滞回线未出现磁滞现象，表明制备的MNPs具有超顺磁性。Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2和Fe3O4@SiO2@NH2@C60的 饱 和 磁 化 值 分 别 为71.3、42.2、32.9、26.6 emu/g，Zhang等［31］证明MNPs的饱和磁化值为16.3 emu/g时在外加磁铁的作用下足以实现固液分离。本文所制备的MNPs虽经进一步的修饰后，磁化强度有所降低，但依然能够快速实现固液分离，使得Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs能够在强磁体的作用下易于从溶液中分离。

图3 Fe3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@NH2和Fe3O4@SiO2@NH2@C60的磁滞回线Fig.3 Hysteresis loops of Fe3O4，Fe3O4@SiO2，Fe3O4@SiO2@NH2 and Fe3O4@SiO2@NH2@C60

2.2 磁固相萃取条件的优化

中药材中PAHs的提取方法对测定结果至关重要，本文参考安徽省地方标准DB 34/T 3304－2018［32］选择超声提取法。该方法高效、省时、易操作，是美国国家环境保护局（USEPA）推荐的PAHs提取方法。为提高整个前处理过程中PAHs的回收率，以葛根（加入500 µg/kg PAHs标准溶液）作为样品，分别对萃取溶剂类型、吸附剂用量、吸附时间、解吸溶剂类型和解吸时间进行了优化，每个实验重复3次。

萃取溶剂种类优化：分别考察了甲醇（MeOH）、正己烷、二氯甲烷（DCM）、丙酮作为萃取溶剂时的效果。由图4A可知，以二氯甲烷作为萃取溶剂时，PAHs的回收率最高，其原因可能是二氯甲烷的沸点最低，PAHs的沸点相对较高，萃取吹干过程中沸点低的物质能很好保护沸点高的物质［28］；并且二氯甲烷的弱极性可使PAHs有更好的溶解度，在双重作用下能够使PAHs在萃取吹干的过程中损失率降到最低。因此选用二氯甲烷作为萃取溶剂。

吸附剂用量优化：分别考察了Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs用量为5、10、15、20 mg时对PAHs回收率的影响。由图4B可知，吸附剂用量由5 mg增至10 mg时，16种PAHs的回收率提升明显；从10 mg上升至20 mg的过程中回收率无明显变化。10 mg吸附剂已能够完全吸附整个体系中的PAHs，更少的吸附剂可以降低实验成本，因此选择最佳的吸附剂用量为10 mg。

吸附时间优化：分别考察了2、4、6、8 min下的吸附效果（图4C）。结果表明，吸附时间从2 min增至4 min时PAHs的回收率也随之增加，从4 min增至8 min时PAHs的回收率保持不变，表明4 min足以使Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs吸附体系中的PAHs。因此，选择吸附时间为4 min。

图4 萃取溶剂种类（A）、吸附剂用量（B）、吸附时间（C）对多环芳烃回收率的影响Fig.4 Effects of extraction solvent type（A），sorbent amount（B） and adsorption time（C） on the recoveries of PAHs

解吸溶剂种类优化：分别考察了甲醇、正己烷、二氯甲烷和丙酮作为解吸溶剂的效果，发现上述溶剂均可解吸PAHs，但正己烷对所有目标物的解吸效率最高。可能是因为正己烷的极性最低，遵循“相似相溶”原理，使PAHs的溶解度最大。因此，选择正己烷为解吸溶剂。

解吸时间优化：以正己烷为解吸溶剂，分别考察了Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs在1、2、3、4 min下对PAHs的解吸情况。结果显示，解吸时间由1 min升至2 min时PAHs的回收率提升明显，且在2 min时回收率达到最高。因此，选择解吸时间为2 min。

2.3 磁纳米粒子的吸附性能

通过吸附葛根（加标500 µg/kg）样品中PAHs考察了MNPs各阶段的吸附能力、稳定性和重复利用率。为证明C60基团在吸附PAHs中的重要作用，在最优条件下比较了各阶段MNPs的吸附能力。结果如图5A所示，Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs对PAHs的吸附能力显著高于其他阶段MNPs（p< 0.05）。Fe3O4MNPs经包硅后对PAHs的富集作用略有减弱，进一步包氨后，对PAHs的富集作用优于Fe3O4MNPs，经过C60修饰后对PAHs的富集作用明显提升，Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs表现出最好的吸附性能。这可归因于C60所具有的π－π共轭体系、多孔、不饱和结构以及较大的比表面积［33］，能增强其与PAHs的相互作用，从而增强了对PAHs的选择性吸附能力。

在最优的条件下，考察了3个不同批次Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs吸附效率的再现性，以评估C60功能化磁纳米粒子的稳定性。如图5B所示，3批C60功能化磁纳米粒子吸附16种PAHs的峰面积大小无显著差异（p> 0.05），表明具有良好的再现性。

图5 各阶段MNPs（A）以及3批次Fe3O4@SiO2@NH2@C60 MNPs（B）对多环芳烃峰面积的影响Fig.5 Effects of MNPs at each stage（A） and Fe3O4@SiO2@NH2@C60 MNPs of three batches（B） on the peak areas of PAHs different letters（a，b，c，d） above the columns for the same substance represent significant differences in PAHs peak area（p < 0.05）

采用Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs的吸附性能评估其重复利用率。在最佳条件下使用Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs吸附PAHs，完成每次吸附−解吸循环后，将Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs用解吸液再解吸2次，使PAHs完全洗脱下来，防止对下次吸附造成干扰，随后进行下一次吸附。结果表明，在10次吸附－解吸循环过程中，Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs吸附16种PAHs的峰面积大小趋于相对稳定，表明其性能可靠且稳定耐用。而Yang等［34］制备的Fe3O4@SiO2@MMTA－Au MNPs重复使用过程中回收率随着使用次数的增加而降低，造成此差异的主要原因是C60结构中含有丰富的π－π键，能使其在吸附－解吸PAHs的过程中有更高的效率。因此，本文制备的Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs稳定性更好，可重复使用，能够大幅降低实验成本。

2.4 方法学考察

在最优的前处理条件下，采用GC－MS考察了16种PAHs的线性关系、检出限（LOD）、定量下限（LOQ）等指标，各物质的总离子流色谱图见图6。由表2可知，16种PAHs的线性范围为5 ~1 000 µg/L，相关系数（r2）为0.994 0 ~ 0.999 9，检出限（S/N= 3）为0.2 ~ 1.2 µg/kg，定量下限（S/N=10）为0.8 ~ 3.9 µg/kg。在葛根样品中加入16种PAHs混合标准溶液（500 µg/kg），通过计算6次重复测定的RSD评估日内和日间精密度（6 d），16种PAHs的日内RSD为0.20% ~ 3.5%，日间RSD为2.2% ~ 6.9%，说明本方法具有良好的重复性。为评估方法的准确性（以回收率表示），在葛根样品中加入100、250、500 µg/kg水平的16种PAHs混合标准溶液，得到平均回收率为84.1% ~ 104%，RSD为0.70% ~ 8.3%（见表3）。结果表明，所建立的MSPE/GC－MS方法可以分析中药材中的痕量PAHs。

图6 PAHs混合标准溶液（250 ng/mL）和定量内标物（100 ng/mL）的总离子流色谱图Fig.6 Total ion flow chromatogram of PAHs mixed standard solution（250 ng/mL） and quantitative internal standards（100 ng/mL）

表2 16种PAHs的线性方程、相关系数、线性范围、检出限、定量下限及精密度Table 2 Linear equations，r2，linear ranges，LODs，LOQs and precisions of 16 PAHs

表3 加标葛根样品中16种PAHs的平均回收率及相对标准偏差Table 3 Average recoveries and RSDs of 16 PAHs in spiked Pueraria lobata

（续表3）

本文对比了MSPE处理后以及未经处理的葛根样品（加标250 µg/kg）的测定结果（图7），表明经MSPE处理后能有效降低中药材样品中复杂基质对PAHs的干扰，可明显提升目标物的测定准确度和重复性。Qin等［35］证明使用MSPE技术处理土壤样品时，其净化效果比硅胶柱法好，且与未净化样品相比，基质效应显著降低。

图7 经过处理与未经处理葛根样品（加标250 µg/kg）的总离子流色谱图Fig.7 Total ion flow chromatograms of treated and untreated Pueraria lobata samples（spiked at 250 µg/kg）

将所建立的方法与其他测定中药材样品中PAHs的方法进行了比较（表4）。相比其他方法，本方法能测定16种PAHs，回收率更高，且具有良好的精密度和线性范围，是一种可快速测定PAHs的方法。

表4 该方法与其他测定多环芳烃方法的比较Table 4 Comparison of the developed method with other methods for the determination of PAHs

2.5 样品测定

将所建立的方法用于检测葛根、玄参、桑椹、栀子、桔梗、牡丹皮、淫羊藿7种中药材中的16种PAHs含量，结果如表5所示。

由表5可知，7种中药材中分别检出8、13、4、9、7、11、11种PAHs，总量为166.9 ~ 1 292.4 µg/kg，桑椹中的PAHs总量最低，栀子中的PAHs总量最高，且栀子中菲的含量达473.4 µg/kg。Ishizaki等［8］在杜仲皮中检出12种PAHs，总量达502.2 µg/kg；Yu等［10］在甘草根和玫瑰花中分别检出14、10种PAHs，总量分别达1 966.0、806.0 µg/kg。欧盟委员会2015年规定干草药中苯并［a］芘的最大含量为10.0 µg/kg，且苯并［a］芘、苯并［a］蒽、苯并［b］荧蒽和䓛4种PAHs的总量最大使用限量为50.0 µg/kg［36］，本文所测定的7种中药材中有4种超过限量标准，可见中药材中PAHs的污染情况比较严重，潜在的健康风险需进一步调查。

表5 7种中药材中16种PAHs的含量（µg/kg，n = 3）Table 5 Contents of 16 PAHs in seven Chinese herbal medicines（µg/kg，n = 3）

3 结 论

本文合成了Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs，以其为吸附剂建立了MSPE/GC－MS同时测定中药材中16种PAHs含量的方法。对Fe3O4@SiO2@NH2@C60MNPs进行了表征以及吸附性能的考察，结果表明MNPs改性成功且具有超顺磁性，吸附能力强，稳定性好，重复利用率高。优化了萃取溶剂种类、吸附时间、解吸时间等前处理条件，并在葛根样品中添加不同浓度水平PAHs进行方法学验证，结果表明方法的回收率及相对标准偏差符合要求。本方法操作性强、快速简便、准确度高和精密度好，可以有效降低中药材样品中复杂基质对PAHs目标物的干扰，能够满足中药材样品中16种PAHs的测定要求。