原发性急性闭角型青光眼患者房水蛋白质组学分析

李君一 袁福杰 刘科琳 王英

原发性急性闭角型青光眼（Primary acute angle closure glaucoma，PAACG）是我国原发性青光眼最常见的类型，病理性眼压升高是急性闭角型青光眼（Acute angle closure glaucoma，AACG）首要的独立危险因素。房水作为重要的眼内液，与血浆中蛋白相比，房水蛋白在质量与数量上与其存在一定差异。与以往观念不同，当前研究认为房水（Aqueous humor，AH）中的蛋白不仅仅是由睫状体的毛细血管滤过产生，局部组织分泌同样参与了AH蛋白的生成[1]。近年来，一些研究认为青光眼房水中一些蛋白的改变参与了疾病的发病过程，与小梁网（Trabecular，TM）细胞外基质的重塑、炎症反应、神经退行性疾病等相关[2-6]。本研究通过蛋白组学分析对眼压高低不同的PAACG房水样本进行检测，探究眼压高低不同的PAACG房水蛋白的差异表达。现报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象

选取2019 年3 月至2020 年9 月期间于吉林大学第二医院眼科中心入院治疗的PAACG患者88例（88眼），按照术前眼情况分为A组[眼压≥50 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），36个样本]和B组（眼压≤21 mmHg，52 个样本）。将上述A、B组样本又分为2个队列：发现队列（A组，26个样本；B组，37个样本）和验证队列（A组，10个样本；B组，15个样本），分别通过数据独立采集（Data-independent acquisition，DIA）方法和平行反应监测（Parallel reaction monitor，PRM）分析房水蛋白。为了减少降眼压药物对房水蛋白组学的影响，所有PAACG患者均使用了布林佐胺滴眼液（比利时爱尔康公司）、酒石酸溴莫尼定滴眼液（爱尔兰艾尔建公司）、卡替洛尔滴眼液（中国广东大冢制药有限公司）等降眼压药物进行治疗。本研究遵循赫尔辛基宣言，并通过伦理委员会批准（2020044），所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 房水采集

所有患者行房水样本采集前3 d，使用左氧氟沙星滴眼液（中国参天制药公司）预防感染，手术准备过程中使用盐酸奥布卡因滴眼液（中国参天制药公司）行表面麻醉。在显微镜下使用1 ml胰岛素注射器（舒锐，上海碧迪医疗器械有限公司）于前房中缓慢抽取约100 μl房水放入无菌EP管中，存贮至-80℃冰箱直至分析。所有的青光眼手术及房水采集过程均由同一经验丰富、操作熟练的医师完成。

1.3 房水蛋白样本制备

1.3.1 蛋白提取 房水样本使用3倍体积的乙醇沉淀过夜，然后在10 625 r/m离心30 min。将蛋白重新悬浮在裂解缓冲液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.1 mol/L二硫苏糖醇和5 mmol/L Tris）中。通过Bradford方法进行蛋白质浓度的测定。

1.3.2 蛋白消化 蛋白样本（50～200 μl）在95℃下用20 mmol/L二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）还原5 min 使蛋白变性，然后在温室黑暗中用55 mmol/L碘乙酰胺烷基化45 min，再加入胰蛋白酶（1:50），在37℃下孵育过夜。消化后将所得肽进行高压液相色谱（High-pressure liquid chromatography，HPLC）分离。

1.3.3 HPLC分离 采用高pH RPLC色谱柱（4.6 mm×250 mm，C18，3 μm；美国Waters公司）分离混合的肽样品。将样品加入到缓冲液A1（H2O，PH=10）中。洗脱梯度为5%～30%的缓冲液B1（90%乙腈，PH=10；流速，1 ml/min）持续30 min。每分钟收集1 份洗脱的肽，将其冻干后，将30 个馏分重悬于0.1%甲酸中，用于液相色谱-质谱（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析。

1.3.4 LC-MS分析 Orbitrap Fusion Lumos tribrid质谱仪（德国Thermo Scientific公司）与EASY-nLC 1000 结合用于依赖数据采集质谱（Data-dependent acquisition，DDA-MS）和数据独立采集-质谱（Data independent acquisition–mass spectrometry，DIAMS）模式下的质谱（Mass spectrometry，MS）分析。在RP C18自填充毛细管液相色谱柱（75 μm×100 mm，3 μm）上分离消化的肽。洗脱梯度为5%～30%缓冲液B2（0.1% 甲酸，99.9%乙腈；流速，0.3 μl/min），持续60 min。

1.3.5 光谱图库的建立及生成 以依赖数据采集（Data-dependent acquisition，DDA）模式分析了RPLC的30 个馏分。在DIA模式下分析每个单独的样品。使用Proteome Discoverer（德国Thermo Scientific公司）软件处理DDA数据，并在附加了iRT融合蛋白序列（瑞士Biognosys公司）的人类SwissProt数据库中进行搜索。将结果导入Spectronaut Pulsar（瑞士Biognosys公司）软件中。

经济全球化和贸易自由化正改变着我们的世界，当今人们处于一个世界性的人口、商品、财富、信息和思想的不断交换之中，这种行为已然构成了复杂的全球性网络[1-3].随着全球化进程的不断加快，世界各个国家和地区间的贸易活动更加频繁，区域经济系统间的相互依赖程度也不断加大[4].

1.3.6 PRM质谱分析 在Triple TOF 5600上进行PRM分析。肽段的分离在RPC18自填充毛细管LC色谱柱（50 μm×500 mm，3 μm）上进行。洗脱的梯度为5%～30%的缓冲液B1（0.1%的甲酸，99.9%的乙腈；流速为0.3 μl/min），持续60 min。为了电离，使用2.10 kV的喷雾电压和60℃的毛细管温度。使用PRM采集模式监控肽段，沿着完整的色谱运行对所有肽段标记物进行前体离子的MS/MS扫描，每个样品运行2次。归一化碰撞能量固定为35%，累积时间为300 s。

1.3.7 数据分析 采用Spectronaut Pulsar（瑞士Biognosys公司）以默认设置分析DIA-MS数据。Q值截止值为0.01对应[发现错误率（False discovery rate，FDR）为1%]过滤所有结果。对于PRM模式，使用Skyline软件（版本3.5.0.9319）为所选的候选肽生物标记物选择合适的m/z前体离子→m/z片段离子跃。

1.3.8 生物信息学分析 蛋白质分类是基于功能注释进行的，使用基因本体论（Gene ontology，GO）对生物过程、分子功能和细胞定位进行蛋白质分类。此外，所有选择的蛋白质均使用IPA软件（美国Ingenuity Systems公司）进行网络分析。

1.4 统计学方法

病例对照研究。采用Prism Graph Pad统计学软件进行数据分析。采用独立样本t检验分析蛋白表达差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定量蛋白质分析

对发现队列中所有的房水样本进行检测，共发现636种蛋白质，通过质量控制分析即去除了50%的默认蛋白质和较高的变异系数（Coefficents of variability，CV）蛋白，获得了506种蛋白质用于后续的分析。对2组样本进行了聚类分析，在非监督与监督模式下，可观察到A、B组具有较好的聚类趋势。差异蛋白筛选标准：P<0.05，倍数变化>1.5。

在506种蛋白质，倍数变化>1.5且P<0.05的蛋白有51个，A/B表示患者房水中平均蛋白水平倍数变化。其中A组上调蛋白有17个，B组上调蛋白有34个。见图1。

2.2 房水蛋白的GO功能分析

本研究对鉴定出的房水蛋白采用IPA软件分析并进行GO功能注释，发现队列中A、B组所有差异蛋白主要参与了细胞进程、对刺激做出反应、代谢过程、生物调节过程、免疫调节等重要生物过程，见图2。为了进一步了解眼压高低不同对于房水中生化途径的影响，我们进行了2组上调蛋白的对比分析。对比了发现队列中A、B组差异蛋白表达，A组差异蛋白在代谢过程、多细胞组织过程、生物调节、对刺激做出反应等生物过程中表达明显上调；B组差异蛋白在细胞过程、生物黏附、定位等生物过程中表达明显上调，见图3。

蛋白质-蛋白质相互作用网络可看到差异蛋白主要与代谢性疾病、神经系统性疾病（阿尔兹海默症）、脂质代谢性疾病相关。众所周知，阿尔兹海默症属于淀粉样变性疾病的一种，见图4。房水中APOA2、CFB、CHI3L1、IGFBP6、IGHA2、MEGF10、PIK3IP1、PROS1、TIMP1和ADGRL1这几种差异性蛋白均在淀粉样变性疾病以及阿尔兹海默症疾病中显现出相关性。其中，与阿尔兹海默症疾病相关的差异蛋白APOA2、CFB、CHI3L1、IGHA2、PROS1和TIMP1在A组表达上调，IGFBP6、MEGF10、PIK3IP1、ADGRL1在B组表达上调，见图5—6。与脂质代谢疾病相关的差异蛋白有APOA2、ARSA、CARTPT、FBN1、NPC2，其中APOA2在A组表达上调，其余均在B组表达上调（红色表示在A组中表达上调，绿色表示在B组中表达上调），见图7。

图1.发现队列中A、B组房水差异蛋白基因名称A组患者（眼压>50 mmHg）房水中蛋白质有17种蛋白质水平表达上调（红色），B组患者（眼压<21 mmHg）房水中蛋白质有34种蛋白质水平表达上调（蓝色）。差异表达为1.5倍变化Figure 1.The names of the differential protein genes in the aqueous humor between groups A and B found in the cohortThe expression of 17 proteins and in the aqueous humor of group A (IOP>50 mmHg) and group B patients (IOP<21 mmHg) was up-regulated (red) and upregulated (blue),respectively.The difference is expressed as a 1.5 fold change.1 mmHg=0.133 kPa.IOP,intraocular pressure.

图2.发现队列中A、B组所有差异蛋白的生物学过程A组：眼压>50 mmHg；B组：眼压<21 mmHgFigure 2.The biological process of discovering all differential proteins in the two groups A and B of the cohortGroup A: IOP>50 mmHg;group B: IOP<21 mmHg.1 mmHg=0.133 kPa.IOP,intraocular pressure.

图3.发现队列A、B组中差异蛋白生物学过程分析对比A组：眼压>50 mmHg；B组：眼压<21 mmHgFigure 3.Analysis and comparison of the biological process of differential proteins found in the two groups A and B of the cohortGroup A: IOP>50 mmHg;group B: IOP<21 mmHg.1 mmHg=0.133 kPa.IOP,intraocular pressure.

2.3 PRM验证

验证队列（A组，10 个样本；B组，15 个样本）选取APOA2、LRP2、VASN、TIMPs进行对比验证，研究结果显示发现队列与验证队列中结果保持一致，见图8。

3 讨论

病理性眼压升高是青光眼发病的首要危险因素，对青光眼患者AH中蛋白质组学的分析，有助于了解眼压高低不同状态下AH中差异蛋白的表达对于眼内微环境的影响。本研究中，我们通过对发现队列中A、B组患者AH中的蛋白组的分析，显示其中有51 种蛋白质存在差异表达，这些蛋白质与中枢神经系统性疾病、炎症反应、脂质代谢等相关的功能网络重叠。本研究认为2组不同眼压的PAACG患者房水中发生的复杂蛋白质组变化将为寻找青光眼特定生物学靶标（用于疾病的预防以及相应治疗策略）提供重要的实验依据。

3.1 炎症相关性差异蛋白的生物学分析

研究证实炎症参与青光眼的发病以及视神经损伤[7-8]。本研究结果显示发现队列中A组患者房水中CHI3L1、CFB、C1RL、LYZ和CD163等差异蛋白表达上调，这些差异蛋白可通过级联反应激活炎症及免疫反应途径，进一步造成眼内压的升高及视神经损伤。

本研究中差异蛋白CHI3L1 在AD以及淀粉样变性中均存在，CHI3L1是1种由局部产生及释放的糖蛋白，可由中性粒细胞、单核巨噬细胞、癌细胞等产生，CHI3L1 被认为与急慢性炎症反应、细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）重塑、血管生成等过程相关。Qiu等[9]的研究发现CHI3L1的过表达可以促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，并可以通过TGF-β信号通路参与ECM的调节，促进纤维化。已有研究显示在剥脱综合征患者血清以及房水中已经发现CHI3L1表达水平上升，并认为其表达增高可能是纤维化过程中早期剥落物异常生成的触发点[10-11]。

血管素是一种I型跨膜糖蛋白，在氧含量正常条件下，其水平较低。而在缺氧条件下血管素表达显著增加，血管素水平升高可以诱导血管内皮细胞的迁移导致血管形成增加[12-14]。而青光眼患者在持续高眼压状态下，眼前节组织处于缺血缺氧状态，并且可在部分患者虹膜上观察到新生血管的形成。

先前已有研究报道补体因子B（Complement factor B，CFB）在组织缺血及免疫过程中表达上调[15]，本研究中发现队列的A组患者房水中的CFB水平升高，可能与持续高眼压状态下，组织缺血引起细胞因子上调有关。CD163通常作为巨噬细胞的抗炎性标志物，参与细胞保护、组织修复重塑以及纤维化过程。Margeta等[16]研究对比了青光眼与正常对照组眼球解剖结构，发现CD163在经典流出途径小梁网和Schlemm管周围表达明显上升，与对照组相比，早期及晚期青光眼视神经中CD163+巨噬细胞显著增加，并形成轴突浸润。

3.2 神经保护性相关差异蛋白的生物学分析

图4.蛋白质—蛋白质相互作用网络图Figure 4.Network analysis diagram of differential proteins and diseases

图5.淀粉样变性相关的差异蛋白在2组中的表达Figure 5.Different proteins related to amyloidosis in the two groups of proteins

图6.阿尔兹海默症相关的差异蛋白在2组中的表达Figure 6.Different proteins related to Alzheimer's disease in the two groups of proteins

图7.脂质代谢相关的差异蛋白在2组中的表达Figure 7.Different proteins related to lipid metabolism in the two groups of proteins

氧化应激刺激是中枢神经系统退行性病变的重要发病机理，神经保护因子可通过抵抗氧化应激过程来保护神经元免受侵害。Jeon等[17]的研究表明IGFBP-6是重要的神经元存活因子，可以保护神经元细胞免受H2O2的氧化应激刺激。VGF神经生长因子是一种神经分泌的营养因子，具有神经保护作用。Takeuchi等[18]的研究显示在视神经挤压发生后的5～7 d内VGF神经生长因子的表达可能随着神经胶质细胞的活化而上调。本研究中发现队列中A组VGF神经生长因子的表达降低，这一改变可能是造成青光眼视神经损伤的原因之一。

糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B（Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B，GPNMB）主要在小胶质细胞中表达，是一种跨膜的蛋白。小胶质细胞的活化是许多神经退行性疾病的特征性表现，已有研究报道多种神经退行性疾病中发现GPNMB水平的升高[19]。GPNMB可通过激活神经胶质细胞分泌至细胞外并负调节炎症反应来抑制炎症反应和阻止神经元变性[20-21]。由此可见，增加GPNMB的水平可能是未来潜在的治疗靶标。

3.3 脂代谢相关差异蛋白的生物学分析

IPA途径分析显示，发现队列中A组蛋白质上调主要与免疫、炎症途径（LXR/RXR激活、急性期反应信号传导）、动脉硬化等信号传导途径相关。其中LXR及RXR为核受体，参与脂质代谢、炎症反应及将胆固醇转化为胆汁酸，本研究中CARTPT、FBN1、NPC2，APOA2、LRP2等差异蛋白与脂质代谢相关[22-23]。

图8.验证队列中A、B组患者房水中TIMP1、VASN、APOA2、LRP2的浓度比较A组：眼压>50 mmHg；B组：眼压<21 mmHgFigure 8.Comparison of the concentrations of TIMP1,VASN,APOA2,and LRP2 in the aqueous humor of patients in groups A and B in the validation cohortGroup A: IOP>50 mmHg;group B: IOP<21 mmHg.a,compared with patients in group A,P<0.05.1 mmHg=0.133 kPa.IOP,intraocular pressure.

APOA2比APOA1的疏水性强，对脂蛋白代谢以及载脂蛋白稳定性有更强的调节性,而脂蛋白的构象改变可增加淀粉样变性的敏感度，在Yang等[24]构建的小鼠动物模型中APOA2在淀粉样变性中起着至关重要的作用。

低密度脂蛋白受体相关蛋白受体2（Lipoprotein receptor-related protein 2，LRP2）是调节神经元生长和修复的重要细胞信号传导介质，具有促进轴突的存活、轴突生长的作用，既往有研究报道LRP2的突变及缺失可能导致眼压升高、视网膜神经节细胞密度降低以及视神经的轴突病变[25-27]。

FBN1的正常表达对维持房水正常流出具有重要的功能作用，FBN1与转化生长因子β结合蛋白1（Latent transforming growth factor β-binding protein 1，LTBP-1）之间的相互作用对于ECM中潜在的TGF-β复合物稳定起重要影响作用，FBN1 的表达下调严重影响复合物的稳定，导致TGF-β的活化[28]，致使房水流出减少。

有研究观察表明CARTPT在神经兴奋调节行为中起着积极作用，一些研究把CARTPT认定为人类内源性抗抑郁药物，相较健康对照组脑脊液中CARTPT水平，重度抑郁症患者显著降低[29-30]。而青光眼作为一种身心性疾病，与正常健康对照组相比，青光眼患者患抑郁的风险显著增高[31-32]。本研究结果显示，发现队列中A组患者房水中CARTPT表达显著低于B组。

3.4 其他

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，M M P）可以降解E C M，减轻房水流出阻力，基质金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）作为MMP的非选择性抑制剂，可以通过1:1与MMP结合从而抑制其活性[33-34]。有研究报道，与白内障对照组相比，无论是POAG还是PACG患者，房水中均显示TIMPs含量增加，MMP/TIMP比例失衡[35]。本研究中可以看到A组房水中TIMP1水平高于B组，表明在高眼压持续状态下，房水中TIMPs的表达上调导致ECM重塑，增加房水的流出阻力，形成恶性循环，眼压进一步升高。

综上所述，PAACG眼压升高可能与免疫炎症反应以及小梁网细胞外基质重塑相关，青光眼可能与阿尔兹海默症等神经退行性疾病一样具有相似的神经损伤病理机制，除此之外，神经保护性蛋白的缺失可能会进一步加重视神经损伤。本研究也存在一些不足之处，我们对眼压高低不同的PAACG患者房水差异蛋白进行了初步探讨，但出于伦理及安全考虑未能够将抗青光眼药物对房水蛋白的影响排除在外，后续我们可通过相关的动物模型及细胞实验展开进一步深入的探究。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明李君一：参与选题、设计及相关文献的分析和总结；撰写论文；根据编辑部的意见进行修改。袁福杰：参与选题、设计及相关文献的分析和总结。刘科琳：参与选题、设计和修改论文的结果结论。王英：参与选题、设计及相关文献的分析和总结，修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行核修