葡萄酒中乙醛及其来源的研究进展

2023-02-18孙雨航王嘉琦崔晓倩王清龙常贺强代玲敏韩国民

中外葡萄与葡萄酒 2023年6期

孙雨航，王嘉琦，崔晓倩，王清龙，常贺强，代玲敏，韩国民*

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东济南 250353）

乙醛是一种强烈的挥发性化合物，源于植物新陈代谢，广泛存在于各种食物（如水果、蔬菜、乳制品）与自然环境中。研究表明，人们接触乙醛的主要途径是饮用酒精饮料，其次是吸烟和食用含有调味剂的各种食品[1]。葡萄酒是一种以葡萄或葡萄汁为原料经全部或部分发酵形成的酒精饮料，乙醛是影响其感官质量的重要羰基化合物之一，在不同种类葡萄酒中含量有所不同。在红白葡萄酒中乙醛含量分别为4～212 mg·L-1和11～494 mg·L-1；在加强型葡萄酒中，如雪莉酒中的乙醛含量（90～500 mg·L-1）明显高于红白葡萄酒[2]。葡萄酒中乙醛含量能明显改变葡萄酒风味特征。Arias-Pérez等[3]研究表明，低浓度乙醛可以带来一些水果等令人愉快的香气特征，高浓度乙醛则会带来类似青草或青苹果等不良氧化气味[4]。此外，当含量较高时，会增强其他醛类（饱和、不饱和和Strecker醛类）的“绿色蔬菜”味以及与高浓度异戊醇相关的“灼烧”效果[3]。同时，在葡萄酒陈酿过程中，乙醛介导的化学反应是酚类物质演变的重要途径之一[5]。酒中乙醛形成途径通常被认为有3种：微生物新陈代谢[2]，芬顿反应作用下乙醇被羟基自由基氧化[6]，乙醇被高度氧化的硫酸盐自由基氧化[7]。

乙醛在葡萄酒中的形成贯彻整个工艺环节且来源途径多样，已经被证明具有高度的化学反应性，参与众多葡萄酒陈酿反应，其含量严重影响葡萄酒的质量[8]。因此，了解生产各阶段乙醛来源对合理控制其含量至关重要。本文旨在概述乙醛在葡萄酒生产中各阶段的主要来源，包括酒精发酵（AF）、苹果酸-乳酸发酵（MLF）、微氧陈酿及瓶贮陈酿，为减少或避免乙醛的产生，提高葡萄酒安全质量提供理论依据。

1 酒精发酵阶段的乙醛

在酒精发酵过程中，乙醛主要来自酵母的新陈代谢，是酒精发酵过程的中间产物，不同酵母菌株的乙醛产生能力有很大差异，且在不同发酵时期的产生量也各不相同。相关研究对葡萄酒中10种常见酵母菌产乙醛的能力进行了分析，认为酿酒酵母与葡萄酒中乙醛水平紧密相关，酿酒酵母产乙醛量为0.5～286 mg·L-1，而德尔布有孢圆酵母产乙醛量仅为0.5～5 mg·L-1[2]。近年对26株酵母产生和降解乙醛能力的研究发现，非酿酒酵母和酿酒酵母表现出相似的代谢动力学，在发酵开始时乙醛含量达到初始峰值，然后部分再利用；并且相比酿酒酵母来说，非酿酒酵母之间的乙醛残留量变化较大，为0～50 mg·L-1不等[9]。

酒精发酵过程中，乙醛的动态变化可以分为3个阶段。首先在发酵开始的延滞期（图1），葡萄糖通过协助扩散的方式进入酵母细胞，经糖酵解途径转化成丙酮酸；丙酮酸在硫胺素焦磷酸（Thiamine-PP）和丙酮酸脱羧酶（Pyruvatedecarboxylases）的作用下生成乙醛和CO2，乙醛在酒精发酵的早期阶段积累起来[10]，达到最大浓度，随后乙醇脱氢酶基因（Adh1p）同工酶的激活导致乙醛转化为乙醇，从而影响乙醛和酒精的积累[11-12]。乙醛的含量缓慢降低，同时NADH被氧化为NAD+，一直持续到酒精发酵结束。在此过程中，有少量的乙醛被乙醛脱氢酶转化为乙酸酯，所以乙醛脱氢酶在葡萄酒发酵中对乙醛的含量同样具有重要影响[13]。其次在酵母生长阶段，所添加的SO2通过与产生的乙醛强烈结合，基本上去除了酒精发酵的末端电子受体[9]；为了维持氧化还原平衡，酵母通过增加乙醛的形成来回应SO2，打破平衡状态，使平衡移动，由此促进了酒精发酵过程中乙醛的积累。最后，到达酒精发酵末期后，在酵母的稳定期乙醛浓度下降[8]，此时乙醛被酵母本身或乳酸菌相继降解[14]，而糖酵解产生的部分丙酮酸会通过丙酮酸脱羧酶（PDC）最终转化为乙醛和CO2。

发酵条件也同样影响酒精发酵过程中乙醛的积累。在模式酒体系下和葡萄汁中的研究表明，各类酵母菌株在发酵初期乙醛的生成量迅速升高，当酵母生长到对数末期时，乙醛生成量达到最大值。对数期结束后，发酵葡萄汁中的乙醛含量迅速降低[15]。试验证明，缓冲液pH的增加会增加S.pombe静息细胞的乙醛峰值和最终浓度，将发酵温度升到30 ℃时，加速了葡萄糖的降解速率，促进了乙醛的生成速率[16]；另外，在酒精发酵阶段厌氧条件、较低pH、高糖和高SO2添加量等都可使酵母产生更多乙醛[17]，并使其在葡萄酒中维持较高的含量。

2 苹果酸-乳酸发酵阶段的乙醛

葡萄酒中还涉及乳酸菌参与的苹果酸-乳酸发酵，几乎所有的红葡萄酒在酒精发酵之后都会进行该过程[18]。MLF中微生物以苹果酸为发酵底物[19]，经苹果酸脱羧酶转化为L-乳酸和CO2，起到降低酸度、优化香气[20]、增强生物稳定性的作用，还可降低酒体变质的风险[19]。此外，酒精发酵积累的乙醛在该过程中可被进一步代谢，但在MLF发酵初期还会生成一定量的乙醛。在葡萄酒pH较低的情况下（pH＜3.5），酒酒球菌（Oenococcus oeni）占据主导地位，同时产生乙醛、双乙酰、乙酸、乙炔和2,3-丁二醇等风味化合物，也有报道[21]认为乳酸菌通过对乙醛的分解代谢改善葡萄酒的香气。在MLF过程中，乳酸菌能够降解结合态SO2，增加游离态SO2[22]，降低乳酸菌活性，从而使MLF过程漫长，导致乙醛大量积累。此外，大量研究表明，在MLF过程中酒酒球菌会代谢乙醛，乳酸菌在葡萄酒中的乙醛还原中起着重要作用[12,23-24]。近期研究证明了另一种与O.oeni功能相似的乳杆菌(L.plantarum)，在MLF过程中提高了葡萄酒的乙醛水平[25]。对比这两种菌在模拟葡萄酒培养基产生的乙醛浓度，由于L.plantarum相对O.oeni来说乙醛消耗率更低，因此接种L.plantarum的培养基中含有更高浓度的乙醛。研究还表明，当基质中存在足够能量时，L.plantarum在MLF过程中可能具有产生乙醛的能力[23]。但是，目前尚不明确乳酸菌在葡萄酒中是否具有合成乙醛的作用[4]。尽管乳酸菌以及MLF环节很重要，但目前很少有研究此过程中乙醛含量变化的报道，在MLF中酒精和乙醛的转化需要更多的研究来证实[15]。

在MLF期间大多数酿酒师都不希望使用微氧处理（Mox），但MLF的自然触发性往往无法避免这种情况。在MLF的不同阶段进行Mox，会产生不同程度的乙醛积累。在MLF前进行Mox，可以使乙醛的化学转化率更高，此时涉及氧气与酚类物质的反应[26]，对葡萄酒结构的改善能起到更好的效果[27]。此外，Dai等[15]在模拟酒系统中的试验结果显示，乳酸菌在微氧化处理的起始阶段会产生乙醛，而乙醛随微生物的作用而变化，一旦触发MLF，乳酸菌就会消耗乙醛，无论Mox如何，乙醛都可以被乳酸菌代谢。

3 微氧处理对陈酿阶段乙醛的影响

Mox可用于酿酒过程的不同阶段。酿酒师通过提供可控水平的氧气，以产生所需的葡萄酒感官效果。在酒精发酵过程中应用Mox的目的是帮助酵母产生膜脂，从而提高酵母活力和乙醇耐受性，在AF之后以及MLF前后应用Mox的主要目的是稳定颜色和改变香气特性，在此过程中对乙醛的产生和消耗会产生一定影响。Mox过程中发生的典型化学反应是葡萄酒主要氧化产物乙醛介导酚类物质发生的缩合和聚合反应[28]。

化学氧化是葡萄酒在微生物发酵后产生乙醛的主要途径。在没有微生物消耗氧气的情况下，乙醛会随着Mox时间的推移不断增加[15]。葡萄酒化学氧化形成乙醛主要通过3个步骤：首先氧气在金属离子（Fe/Cu）催化作用下，将酚类物质转化为醌类物质，同时氧气被还原为过氧化氢；然后过氧化氢与Fe（II）和Cu（I）一起启动芬顿反应，产生羟基自由基[29]；羟基自由基是氧自由基中已知氧化活性最强的氧化剂，几乎可以氧化葡萄酒中所有成分，但是它的寿命很短，作用半径很小，仅能和它邻近的分子发生反应，将除水外含量最高的乙醇，氧化生成乙醛[30]。其反应速率主要取决于SO2的浓度[31]、其他抗氧化剂（如谷胱甘肽[5]）的浓度和葡萄酒中可用活性多酚的水平[30]。

氧气的消耗和乙醛积累的关系对于科学管理葡萄酒陈酿，获得更高品质的葡萄酒有着重要的意义。Almudena等[32]比较了外源乙醛和过度氧化对葡萄酒陈酿中乙醛变化的影响，结果表明过度氧化葡萄酒中没有积累较多的乙醛不是因为生成的乙醛参与了陈酿反应，而是化学氧化不会快速产生较多的乙醛，认为大部分不参与氧化SO2的H2O2并没有全部用于氧化乙醇生成乙醛，而是可能氧化了葡萄酒中的其他主要成分。

氧气可以提高酵母的活力和乙醇耐受性[12]。有研究表明，发酵后微氧处理一段时间后，会使葡萄酒重新出现有活力的酿酒酵母[33]。该阶段存在的酵母进行有氧呼吸的耗氧率远大于化学氧化，并且酵母有氧代谢会比化学氧化更快地积累乙醛[15,34]。

4 瓶贮陈酿阶段的乙醛

新鲜葡萄酒在感官方面往往存在一些不足，通常在瓶中储存一段时间后会达到最佳饮用期。在瓶储过程中，葡萄酒内部发生一系列氧化反应，乙醇通过化学氧化形成的乙醛有助于改善葡萄酒的香气，乙醛可以作为瓶装葡萄酒发生氧化的标志[35]。

瓶储过程中，在Fe2+/Fe3+催化作用下氧气通过芬顿反应形成H2O2和HO-，从而使乙醇氧化生成乙醛[35]，此过程产生的H2O2会促进芬顿反应中乙醛的积累。瓶储葡萄酒中乙醛的产生和积累很大程度上取决于葡萄酒中氧气的可用性，高浓度的氧气有利于挥发性化合物的积累[36]，因此，瓶塞对乙醛的产生与积累也会有一定影响，水平放置的葡萄酒酒液与瓶塞接触，会减缓气体传输速率，避免乙醛的过量积累，从而影响葡萄酒品质。此外，瓶塞类型（透氧性）也会通过影响自由态SO2含量进而对葡萄酒颜色参数（耐亚硫酸盐漂白色素）产生影响[37]，较高透氧量的瓶塞，可以使更多的氧气进入葡萄酒，而葡萄酒氧化产生的乙醛可以介导花色苷与单宁生成聚合色素[38]，这些色素能耐亚硫酸盐漂白并不受pH变化的影响，能够稳定存在于葡萄酒中，对葡萄酒颜色稳定性具有积极作用。瓶贮陈酿阶段时葡萄酒中SO2含量高，会抑制葡萄酒中乙醛的产生[37-39]，游离SO2通过与酚类氧化产物反应，阻断乙醇被酚类物质氧化从而抑制乙醛的生成。当然，如果发生过度氧化，瓶中的醋酸菌，会代谢乙醛生成醋酸，这是葡萄酒变质的标志。

研究表明，温度、曝光和放置方式均会影响到葡萄酒氧化速率，从而影响瓶储过程中乙醛的产生和积累[35]。温度高于20 ℃时，葡萄酒会加速氧化。光照（尤其是紫外线）是葡萄酒发生氧化及产生反应性氧化物质的重要条件，因此葡萄酒在储存过程中的曝光也会加速其氧化，进而促进乙醛的产生。

5 其他来源的乙醛

除了酵母，在葡萄和酿酒设备中存在的重要污染微生物醋酸菌也会产生乙醛[2]。在氧气参与下，醋酸菌可以先将乙醇氧化成乙醛，进一步将乙醛氧化成乙酸。当乙酸浓度达250 mg·L-1[24]，已远高于葡萄酒中挥发性香气化合物的感官阈值。如果此时处于低氧或乙醇浓度高于10%的情况下，则会阻止乙酸的转化，从而造成乙醛的积累，影响葡萄酒品质。

不同葡萄酒中乙醛含量不同。与红葡萄酒相比，雪莉酒的乙醛含量要高很多。其中，菲诺型雪莉酒经历了生物陈酿[40]，当乙醇含量低于15%（Vol）时，葡萄酒表面的flavor酵母进行生物陈酿，产生大量乙醛。乙醛作为生物陈酿过程中产生的最主要的挥发性化合物之一[41]，对雪莉酒独特的感官特性有重要的贡献。菲诺雪莉酒的生物陈酿发生在酒精发酵结束后，酵母由发酵代谢变成氧化代谢，在酒液表面形成一层白色生物膜，保护葡萄酒免受过度氧化[42]。此时，乙醛由酵母产生，主要生成途径是乙醇被ADH II氧化。有研究表明，在使用不同酿酒酵母菌种生产的雪莉酒研究中发现，具有高乙醇脱氢酶II活性的酵母菌种最能体现雪莉酒典型的感官特性。因为这类菌株在薄膜中缓慢而持久的生长使得乙醛在葡萄酒中能够持续积累[42]，并且可以加速乙醇、甘油和挥发性酸的消耗[40]。