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长链非编码RNA X失活特异转录物调控miR-340-5p对卵巢癌细胞上皮间质转化的影响

2023-02-17姜平郭哲梁殿迅杨喜科付小玲李和丽

实用医学杂志 2023年1期
关键词:划痕荧光素酶细胞系

姜平 郭哲 梁殿迅 杨喜科 付小玲 李和丽

河南省南阳市中心医院(河南南阳 473000)

卵巢癌在全球女性癌症患者中病死率最高[1-2]。由于缺乏有效和准确的诊断标志物,发现时往往已到晚期[2]。复发和转移是导致卵巢癌患者死亡的重要原因,有研究发现癌细胞转移和侵袭与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)密切相关[3]。近年来,越来越多的长链非编码RNA(long non-cording RNAs,lncRNA)被发现通过调节微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)在卵巢癌中作为癌基因和抑癌因子[4-5]。lncRNA X 失活特异转录物(X-inactive specific transcript,XIST)能够促进食管癌、结直肠癌发展[6-7]。下调lncRNA XIST 可抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为[8]。因此,lncRNA XIST 是一种潜在的卵巢癌诊断标志物,但其调控机制尚不清楚。生物信息学分析显示miR-340-5p 可能是lncRNA XIST 的下游靶点,其在结肠癌、乳腺癌等多种人类恶性肿瘤中调控肿瘤生长和进展[9-10]。然而,在卵巢癌中,lncRNA XIST 和miR-340-5p 之间的潜在调控轴尚不清楚。本研究将探讨lncRNA XIST 通过EMT 影响卵巢癌细胞迁移、侵袭的作用及其机制,为卵巢癌提供潜在的预后标志物。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器 lncRNA XIST 干扰载体(silncRNA XIST)质粒及其阴性对照(si-NC)、miR-340-5p 模拟物或抑制剂(miR-340-5p mimics 或miR-340-5p inhibitor)及其阴性对照(NC mimics 或NC inhibitor)、RT-qPCR 引物购自上海生工生物技术公司;Lipofectamine 2000 购自英国Invitrogen 公司;TaqManTMmicroRNA 反转录试剂盒和高容量cDNA反转录试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific 公司;qPCR 试剂盒购自日本Takara 公司;双荧光素酶检测试剂盒、Matrigel、放射免疫沉淀试剂盒购自北京索莱宝科学技术公司;BCA 蛋白检测试剂盒购自广州捷倍斯生物科技有限公司;兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GADPH 抗体及羊抗兔抗IgG 购自Abcam 公司;FITC 标记的山羊抗兔抗体购自美国Santa Cruz 生物公司;4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)购自美国Sigma-Aldrich 公司。RT qPCR 仪购自ABI 公司;Glomax 20/20 荧光检测器购自Promega 公司;XDS 800D 倒置显微镜购自上海凯肯光学仪器有限公司。

1.2 组织样本 收集2018-2021年本院28 例卵巢癌手术患者组织标本。正常组织来自于卵巢楔形活检或附件切除术的纤维状瘤或子宫腺肌症。卵巢切除后,取下生殖上皮并进一步分析。本研究经本医院伦理委员会批准,所有患者均签署书面知情同意书。

1.3 细胞培养、分组与转染 购自BNCC 公司的人正常卵巢上皮细胞IOSE80 和人卵巢癌细胞系ES-2、CoC1、SK-OV-3 和A2780 在添加10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养,维持在5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下。

实验分为Control 组(不转染)、si-NC 组(转染si-NC)、si-lncRNA XIST 组(转染si-lncRNA XIST)、si-lncRNA XIST+NC inhibitor 组(转染si-lncRNA XIST 和NC inhibitor)、si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 组(转染si-lncRNA XIST 和miR-340-5p inhibitor)。第3 代的A2780 细胞接种到24 孔板(2×106个/孔),然后培养至单层细胞。当细胞融合达到75%时,去除培养基,转染细胞。在转染前1 d,指数期生长的细胞被播种到6 孔细胞培养板中。孵育12 h后,使用Lipofectamine 2000进行细胞转染。

1.4 RT-qPCR 检测lncRNA XIST 和miR-340-5p表达水平 使用TRIzol 收集卵巢癌组织、细胞系及转染48 h 后的各组A2780 细胞的总RNA。采用TaqManTMmicroRNA 反转录试剂盒和高容量cDNA反转录试剂盒进行反转录。以GAPDH 和U6 为内参,用qPCR 试剂盒配置PCR 反应体系(25 μL)。将PCR 反应液置于RT-qPCR 仪上进行PCR 反应。最后,使用2-ΔΔCT方法进行数据分析。PCR 引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 双荧光素酶实验证实lncRNA XIST 和miR-340-5p 的调控关系 利用在线网站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)分析lncRNA XIST和miR-340-5p 之间的靶向关系。基于二者的结合序列,分别设计目标和突变序列,并将合成后的片段克隆到psiCHECK 2 载体中,进而获得野生型/突变型(WT/MUT-lncRNA XIST)载体质粒。将重组质粒与miR-340-5p mimics 或NC mimics 共转染至A2780细胞,记为NC mimics+WT-lncRNA XIST 组、miR-340-5p mimics+WT-lncRNA XIST 组、NC mimics+MUT-lncRNA XIST 组、miR-340-5p mimics+MUT-lncRNA XIST 组。48 h 后,按照双荧光素酶检测试剂盒的说明检测荧光素酶活性的变化。用Glomax 20/20 荧光检测器记录这些变化,将si-NC、si-lncRNA XIST、pcDNA、pc-lncRNA XIST 分别转染至A2780 细胞,记为si-NC 组、si-lncRNA XIST 组、pcDNA 组、pc-lncRNA XIST 组,48 h 后收集细胞,根据1.4 的方法检测各细胞中miR-340-5p 的表达。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力 将各组A2780细胞制备成细胞悬液,以细胞密度为1 × 105个细胞/孔接种于6 孔板中。当细胞融合达到90%时,用200 μL 的无菌针尖在平板每孔底部做4 个标记。除去原培养基后,每孔补充2 mL 含10%血清的培养基并孵育。分别于划痕后0 h 和24 h 倒置显微镜下拍照,至少测量5 个划痕点的间距,取平均值。各组划痕愈合率=(0 ~ 24 h)划痕面积/0 h划痕面积×100%。

1.7 Transwell 法评估细胞侵袭能力 用Matrigel(1∶8)在24 孔板上覆盖Transwell 室底膜的上室。在上室中加入200 μL 的细胞悬液(1×105个/mL),在下室中加入含20%胎牛血清的DMEM 培养基600 μL,在37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h。将上室表面非侵袭细胞擦拭干净,剩余细胞用4%多聚甲醛固定15 min,0.5%结晶紫溶液染色15 min。倒置显微镜下,选择5 个视野拍照。

1.8 Western blot 分析EMT 标志蛋白水平 转染48 h后,提取A2780细胞总蛋白,然后用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。用10%SDS-PAGE分离蛋白质,转膜后用含5%牛血清白蛋白的Tween-20 溶液的Tris-缓冲盐水阻断膜。随后,用稀释的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 多克隆抗体和GADPH在4 ℃孵育膜过夜。次日,用羊抗兔IgG 抗体在室温下孵膜培养。通过电化学发光观察条带。

1.9 免疫荧光染色观察EMT 标志蛋白表达 首先,用甲醇固定细胞,用0.1% Triton X-100 渗透细胞膜。接着,细胞与一抗(E-cadherin、N-cadherin 或Vimentin)在4 ℃孵育过夜。24 h 后,细胞与FITC标记的山羊抗兔抗体孵育2 h。细胞核用DAPI 染色。图像用倒置显微镜拍摄。

1.10 统计学方法 资料均采用正态分布和方差齐性检验进行分析。符合正态分布的计量资料以平均值±标准差表示。将正常组织与癌组织数据进行t检验比较。多组间数据采用单因素方差分析进行比较。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌组织和细胞系中的表达水平 与正常组织相比,卵巢癌组织中lncRNA XIST 表达升高,miR-340-5p 表达降低(P<0.05),见图1A。与IOSE80细胞相比,ES-2、CoC1、SK-OV-3 和A2780 细胞系中lncRNA XIST 表达增高,miR-340-5p 表达降低(P<0.05),见图1B。由于A2780 细胞中lncRNA XIST、miR-340-5p 表达水平与IOSE80 细胞差异最明显,故选择A2780 细胞进行转染实验。

图1 lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌组织和细胞系中的表达水平Fig.1 Expression levels of lncRNA XIST and miR-340-5p in ovarian cancer tissues and cell lines

2.2 lncRNA XIST 靶 向下调miR-340-5p 表达 StarBase 网站预测显示lncRNA XIST 与miR-340-5p存在互补位点,见图2A。与NC mimics+WT-lncRNA XIST 组相比,miR-340-5p mimics+WT-lncRNA XIST 组荧光素酶活性降低(P< 0.05),见图2B。此外,si-lncRNA XIST 组miR-340-5p 水平高于si-NC 组,pc-lncRNA XIST 组miR-340-5p 水平低于pcDNA 组(P<0.05),见图2C。

图2 lncRNA XIST 靶向结合miR-340-5p 并下调miR-340-5p 表达Fig.2 lncRNA XIST targets miR-340-5p and downregulates miR-340-5p expression

2.3 转染si-lncRNA XIST抑制卵巢癌细胞迁移 与Control 组、si-NC组比较,si-lncRNA XIST 组lncRNA XIST 水平、划痕愈合率下降(t= 26.497、26.931、56.383、56.040,P<0.05);与si-lncRNA XIST组、si-lncRNA XIST+NC inhibitor组相比,si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 组lncRNA XIST 水平、划痕愈合率增加(t= 24.325、23.456、48.614、48.190,P<0.05),见图3。

图3 转染si-lncRNA XIST 影响卵巢癌细胞迁移(×50)Fig.3 Effect of si-lncrNA XIST transfection on migration of ovarian cancer cells

2.4 转染si-lncRNA XIST 抑制卵巢癌细胞侵袭 si-lncRNA XIST 组细胞侵袭数低于Control 组、si-NC 组(t= 33.115、32.526,P< 0.05);si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 组细胞侵袭数高于silncRNA XIST 组 和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 组(t=26.207、25.425,P<0.05),见图4。

2.5 转染si-lncRNA XIST抑制卵巢癌细胞EMT 与Control 组 和si-NC组相比,si-lncRNA XIST 组E-cadherin mRNA 和蛋白表达水平升高,N-cadherin和Vimentin 的mRNA 和蛋白表达水平降低(P<0.05);与si-lncRNA XIST 组和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 组相比,si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 组E-cadherin mRNA 和蛋白表达水平下降,Ncadherin 和Vimentin 的mRNA 和蛋白表达水平增高(P<0.05),见图4、表7。另外,图5 显示,与Control组和si-NC 组比较,si-lncRNA XIST 组E-cadherin 表达增强,N-cadherin 和Vimentin 表达减弱;与si-lncRNA XIST 组 和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 组 比较,si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 组E-cadherin 表达减弱,N-cadherin 和Vimentin 表达增强。

图4 转染si-lncRNA XIST 影响卵巢癌细胞侵袭(×200)Fig.4 Effect of si-lncrNA XIST transfection on ovarian cancer cell invasion

图5 转染si-lncRNA XIST 影响卵巢癌细胞EMT 标志物表达(×200)Fig.5 Effect of si-lncrNA XIST transfection on EMT marker expression in ovarian cancer cells

3 讨论

EMT 是一个复杂的过程,癌细胞表现为极性丧失和细胞表型从上皮细胞到间充质细胞形态的改变,被认为是血管生成上调、细胞运动性增强和细胞外基质侵袭等典型肿瘤表型的先决条件,也被认为是肿瘤侵袭和转移的重要步骤[11]。通过EMT,转化的上皮细胞获得间充质特征,具有间充质表型的单个癌细胞可以穿过内皮屏障进入血液和淋巴循环[12]。这一过程的关键分子特征是上皮细胞标记物E-cadherin 的下调和间质细胞标记物N-cadherin、Vimentin 的上调[13-14]。

许多研究[15-17]表明,lncRNA可以通过参与EMT进程影响肿瘤的侵袭和迁移。lncRNA XIST 是一种17 kb 的lncRNA,通过调控哺乳动物X 染色体失活,获得XX 女性和XY 男性之间的基因剂量等效值[18]。相关文献显示,lncRNA XIST 能促进卵巢癌、宫颈癌的进展以及胶质瘤的EMT[19-21]。本研究结果显示,lncRNA XIST 在卵巢癌组织和4 种卵巢癌细胞系中均上调表达,这与JIANG 等[8]的发现一致,说明lncRNA XIST 在卵巢癌中发挥致癌作用。另外,以lncRNA XIST 表达最高的A2780细胞为转染对象,通过转染si-lncRNA XIST 下调lncRNA XIST 表达后,A2780 细胞的迁移和侵袭能力被抑制,此外,干扰lncRNA XIST 可显著提高E-cadherin 表达,降低N-cadherin 和Vimentin 表达,与既往研究一致,提示干扰lncRNA XIST 表达能够抑制卵巢癌细胞的EMT 进程,进而抑制细胞迁移和侵袭。

以往研究[22]表明,lncRNA XIST 对卵巢癌的影响通过调控miRNA实现,其下游靶点包括miR-335、miR-106a[23]等。本研究根据StarBase 预测网站发现miR-340-5p 是lncRNA XIST 的一个可能靶点。miR-340-5p 可能是结直肠癌的一种新的预后生物标志物和治疗靶点,其通过直接靶向结直肠癌中的ANXA3 发挥其抑瘤功能[24]。miR-340-5p 在甲状腺癌中高表达,其过表达可显著促进甲状腺癌增殖[25]。然而,miR-340-5p 在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究在卵巢癌组织和细胞系中检测到显著降低的miR-340-5p 水平,说明miR-340-5p 可能在卵巢癌中发挥抑癌功能,这与miR-340-5p 在甲状腺癌中的作用相反,提示miR-340-5p 的表达趋势与癌细胞的类型相关。荧光素酶实验进一步证实了lncRNA XIST 与miR-340-5p 之间的直接调控关系。抑制miR-340-5p 表达在体外逆转了干扰lncRNA XIST 对卵巢癌迁移、侵袭及EMT 的作用。这说明lncRNA XIST 通过抑制miR-340-5p 在卵巢癌中发挥致癌作用。

综上所述,lncRNA XIST 通过靶向下调miR-340-5p 促进卵巢癌细胞EMT 和迁移、侵袭,有助于探索卵巢癌新的治疗策略。然而,本研究还存在一些不足之处。第一,卵巢癌的临床样本量较少;第二,未进行体内实验。基于这两点,未来将通过扩大临床组织样本量,并采用荷瘤裸鼠实验,深入研究lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌中的功能和作用机制。

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