七种植物精油的抗菌活性及其抑菌成分分析
2023-02-16张林会邓楠旷春桃
张林会，邓楠，旷春桃
(中南林业科技大学 材料科学与工程学院，长沙 410004)
食源性致病菌所导致的食物中毒和食源性疾病是全球食品安全面临的重要挑战，直接关系到人类健康和环境安全，而化学合成的抗菌剂有致癌性、致畸性以及易引起食物中毒等食品安全问题，因此，安全、高效天然抗菌剂的开发显得尤为重要。植物在抵御不利生存环境胁迫过程中，形成对植物具有保护作用的萜类化合物、酚类化合物和含氮有机物等次生代谢物，其中以萜类化合物为主要成分的植物精油主要用于防御虫害以及致病菌侵扰[1]。植物精油主要来自于植物的花、叶、茎、种子、果实、根或皮中的挥发性成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及驱避昆虫等作用[2-6]。香芹酚和丁香酚分别是牛至挥发油和丁香挥发油的抑菌活性成分[7]，姜黄油对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有良好的抑制活性，主要抗菌活性成分是芳姜黄酮和姜黄酮[8]，山苍子油及其主要成分柠檬醛对黑曲霉、非白色念珠菌、黄曲霉、白色念珠菌、皮肤癣菌和根霉等具有很好的抑制活性[9]。上述研究表明，萜类化合物及其含氧衍生物赋予了植物精油抗菌活性[10—12]，我国具有丰富的芳香植物资源，为天然抗菌剂或抗菌活性成分的筛选奠定了基础。
本研究以我国南方特色芳香植物的精油为研究对象，采用滤纸片法研究了山苍子精油、柏木精油、姜黄精油、八角茴香精油、香桂精油、杉木精油和迷迭香精油对4种供试菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉和根霉)的体外抑菌作用，并对其抗菌活性成分进行了分析，以期为天然抗菌剂和抗菌活性成分的筛选提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
山苍子、香桂叶、柏木、杉木：永顺县源植天然香精香料有限责任公司；姜黄、迷迭香叶、八角茴香：长沙市高桥中药材市场。
细菌：大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)；真菌：黑曲霉(A.niger)、根霉(Rhizopus)，均由中南林业科技大学微生物实验室提供。
胰蛋白胨(生物试剂)、酵母提取物(分析纯)：北京奥博星生物技术有限责任公司；青霉素钠：哈药集团制药总厂；琼脂粉(生物试剂)：天津市科密欧化学试剂有限公司；葡萄糖、二甲基亚砜、氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇(均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 主要仪器与设备
Clarcus 600气相色谱-质谱联用仪 美国Perkin Elmer公司；YJ-VS-1单人垂直超净工作台 无锡一净净化设备有限公司；DSX-18L手提式高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；HPX-9052MBE恒温振荡培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 植物精油的提取
将山苍子、姜黄、柏木、八角茴香、香桂叶、杉木和迷迭香叶粉碎，然后采用水蒸气蒸馏法提取4 h，静置分层，得到山苍子精油(LC-EO)、姜黄精油(RCL-EO)、柏木精油(CF-EO)、八角茴香精油(LV-EO)、香桂叶精油(LCS-EO)、杉木精油(CL-EO)和迷迭香精油(RO-EO)。
1.3.2 植物精油的体外抗菌活性测定
培养基：细菌采用LB培养基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂粉20 g，蒸馏水定容至1 L，调节至pH 7.0～7.2)；真菌采用PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水定容至1 L)，120 ℃灭菌30 min，待用。
供试样品溶液的制备：以灭菌后的DMSO为溶剂，采用两倍稀释法将植物精油和青霉素钠分别配制成系列不同浓度的供试样品溶液和阳性对照溶液。
菌悬液的制备：活化后的细菌在34 ℃下培养8～10 h，真菌在32 ℃下培养12～16 h，然后用无菌水稀释到106～107CFU/mL的菌悬液，备用。
参照文献[13-14]进行测定。在无菌条件下，将20～25 mL的培养基倒入培养皿中制成平板，凝固冷却后，分别取200 μL不同菌悬液均匀涂布于相应的培养基表面，然后将灭菌直径为5.5 mm的滤纸片贴在含菌平板上，滴加5.0 μL不同浓度的供试样品溶液，在恒温培养箱中培养，细菌在34 ℃下培养24 h，真菌在32 ℃下培养48 h，通过抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)评价植物精油的抑菌活性。以青霉素钠为阳性对照，DMSO为阴性对照，每个实验组重复3 次。
1.3.3 GC-MS分析
为进一步确定具有良好抗菌活性的植物精油的抑菌化学成分，采用GC-MS对山苍子精油、姜黄精油、柏木精油和八角茴香精油进行化学成分分析。
气相色谱条件：Elite-5MS分析色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；以He为载气；进样量为0.5 μL；进样口温度为250 ℃；分流比为60∶1；稀释比为20∶1。升温程序如下：
山苍子精油：初温80 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温至100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升温至130 ℃，保持3 min，以20 ℃/min升温至230 ℃，保持6 min。
姜黄精油：初温80 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温至250 ℃，保持2 min。
柏木精油：初温80 ℃，保持2 min，以3.5 ℃/min升温至230 ℃。
八角茴香精油：初温60 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升温至180 ℃，以10 ℃/min升温至250 ℃，保持1 min。
质谱条件：EI离子源；电子能量70 eV；离子源温度240 ℃；扫描范围35～500 m/z。
2 结果与分析
2.1 植物精油的抑菌性能分析
7种植物精油和阳性对照在不同浓度下的抑菌圈直径见表1，最小抑菌浓度(MIC)见表2。
表1 7种植物精油对供试菌株的抑菌圈直径(mm)Table 1 The inhibition zone diameters (mm) of seven kinds of plant essential oils against the tested strains
续 表
表2 7种植物精油对供试菌株的最小抑菌浓度(MIC)Table 2 The MIC of seven kinds of plant essential oils against the tested strains
由表1和表2可知，7种植物精油对4种供试菌均具有不同程度的抑制作用，对真菌的抑制活性优于细菌。山苍子精油的抗菌活性最好，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、根霉的MIC分别为3.13，6.25，1.56，3.13 mg/mL，尤其对黑曲霉的抑制效果好；其次是姜黄精油、柏木精油和八角茴香精油，对4种供试菌的MIC均小于12.5 mg/mL，其中对根霉的MIC分别为3.13，1.56，3.13 mg/mL。香桂精油、杉木精油和迷迭香精油的抗菌作用较弱。
2.2 植物精油的抑菌化学成分分析
为了分析山苍子精油、柏木精油、姜黄精油和八角茴香精油的抑菌成分，对上述4种精油进行了GC-MS分析，相对含量大于0.5%的化学成分见表3。
表3 植物精油的主要化学成分Table 3 The main chemical components of plant essential oils
续 表
山苍子精油中相对含量大于0.5%的化学成分有14个，占山苍子精油的96.69%，其中含量最高的是柠檬醛(香叶醛和橙花醛)，相对含量为74.07%，其次为柠檬烯(8.10%)。研究表明，柠檬醛能够使菌株细胞膜超极化，破坏其细胞膜结构，使细胞内容物泄露，进而影响其正常新陈代谢，抑制微生物的生长繁殖或导致其死亡。柠檬烯能使大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等微生物的膜结构发生变化，影响细胞膜的通透性，干扰细胞的正常代谢活动，导致菌体死亡[15]。因此，山苍子精油对4种供试菌的抑菌活性好，主要抑菌成分为柠檬醛和柠檬烯。
柏木精油中相对含量大于0.5%的化学成分有10个，占柏木精油的93.91%，倍半萜(78.05%)及其含氧衍生物(柏木醇，10.33%)为其主要成分。萜类化合物会破坏细胞膜的完整性，造成细胞内容物的泄露和细胞生理功能紊乱，同时，抑制细菌蛋白和核酸的合成，从而抑制微生物生长或导致细菌死亡[16]。
姜黄精油中相对含量大于0.5%的化学成分有12个，占姜黄精油的79.92%。主要成分为芳姜黄酮(37.88%)、姜黄酮(11.82%)、β-倍半水芹烯(7.82%)和α-姜黄烯(6.71%)。Negi等研究表明，芳姜黄酮、姜黄酮等是姜黄油的抑菌化学成分。
八角茴香精油中相对含量大于0.5%的化学成分有6个，占八角茴香精油的98.11%。其中茴香脑(87.79%)含量最高，其次为茴香醛。张赟彬等[17]研究表明，茴香脑和茴香醛对大肠杆菌菌液的还原糖含量、蛋白质含量、电导率均有影响，在作用4 h后，菌体的细胞结构被完全破坏，蛋白质等大分子物质也全部溶于菌液中，同时，八角茴香精油中多种成分具有协同作用。
3 结论
本研究采用滤纸片法测定了我国7种芳香植物精油在不同浓度下的抑菌圈直径以及最小抑菌浓度(MIC)，然后采用GC-MS分析和确定了抗菌活性好的4种植物精油的主要抑菌成分。结果表明，山苍子精油的抗菌活性最好，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、根霉的MIC分别为3.13，6.25，1.56，3.13 mg/mL，抑菌成分主要为柠檬醛和柠檬烯。姜黄精油、柏木精油和八角茴香精油的抗菌活性较好，对4种供试菌的MIC均小于12.5 mg/mL，芳姜黄酮、姜黄酮是姜黄油的抑菌化学成分，柏木精油的抗菌成分是萜类化合物，八角茴香精油的抑菌成分是茴香脑和茴香醛。香桂精油、杉木精油和迷迭香精油的抗菌作用较弱。综上所述，山苍子精油、姜黄精油、柏木精油和八角茴香精油或其抗菌成分具有开发为天然抗菌剂的潜力。
