响应面优化HS-SPME-GC-MS法分析美味牛肝菌挥发性风味物质

郭磊，李为兰，鲁斌，王德新，刘云，王军民

(1.西南林业大学 云南省高校大健康类森林资源开发利用工程研究中心,昆明 650224;2.西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室,昆明 650224)

挥发性风味物质是食用菌的重要感官指标,也是评价其成熟度、加工方式及品质的重要指标,主要包括八碳化合物、含硫化合物、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类等[1-2]。八碳化合物和含硫化合物因含量丰富且识别阈值低,对风味品质的影响较大,故被公认为是食用菌中的特征挥发性风味物质[3]。挥发性八碳化合物是食用菌中最重要的风味物质,具有浓郁的蘑菇味,最具代表性的是1-辛烯-3-醇[4]。挥发性含硫化合物是构成食用菌中风味物质的另一种重要化合物,能够影响食用菌的整体风味。Morita等[5]最早从香菇中分离出1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷(香菇素, lenthionine),被认为是香菇最重要的挥发性含硫化合物。之后,越来越多的挥发性含硫化合物从食用菌中被检测出来,包括硫醚类、硫醇类和含硫杂环化合物等。醛类、酮类、酸类、酯类及其他杂环类化合物也呈现出食用菌的特殊香味[6]。复合调味料是一种兼具天然、便利、营养及风味等特点的新型产品,在我国的生产和应用历史非常悠久,一款营养价值高、色香味俱佳的复合调味料会越来越受到人们的欢迎[7-8]。因此,分析挥发性风味物质并研究其在不同食品加工过程中的变化规律,不仅可以在食用菌加工过程中进行风味品质控制,还可以促进食用菌产业特别是复合调味品产业的开发升级。

目 前,食品中挥发性风味物质的提取方法主要有顶空分析法(HS)、固相微萃取法(SPME)、同时蒸馏萃取法(SDE)、超临界CO2流体萃取法等[9],其中,HS-SPME集采样、萃取、浓缩及样品导入于一体,具有高效快速、灵敏度高、易于自动化等优点[10],在食用菌[11]、醋[12]及酱料[13]等食品工业中有着十分广泛的应用。美味牛肝菌(BoletusedulisBull.)属于担子菌门、层菌纲、牛肝菌目、牛肝菌科、牛肝菌属[14]。中国是美味牛肝菌的主产区,主要分布于西南和东北森林资源富集区,以西南地区的种类最丰富,而云南产量最大[15-16]。新鲜美味牛肝菌含水量高、呼吸作用强,易发生褐变、萎蔫等现象，导致商品价值降低,干燥能够降低美味牛肝菌中的水分含量,抑制酶的活性及微生物的生长繁殖,从而延长货架期[17]。然而,不同干燥方法对美味牛肝菌干制品中挥发性风味物质的影响不同。本研究在单因素试验结果的基础上,采用响应面法优化美味牛肝菌挥发性风味物质的顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)条件,并结合气质联用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分别对恒温干燥、真空干燥及真空冷冻干燥后美味牛肝菌伞部、杆部的挥发性风味物质进行分析,比较3种干燥方式对美味牛肝菌挥发性风味物质的影响,以期为美味牛肝菌资源的综合利用及其调味品研发提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

新鲜美味牛肝菌:2021年7月购自昆明市木水花食用菌交易市场。新鲜美味牛肝菌经挑选、清洗后擦干,将伞部、柄部分别切成1 cm的薄片,分别置于70 ℃恒温干燥、70 ℃真空干燥及真空冷冻干燥至恒重,粉碎过筛后备用。

BSA224S电子分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;FreeZone®(Plus) 4.5 L冷冻干燥机 美国Labconco公司;RCH-1000顶空固相微萃取装置 上海爱朗仪器有限公司;7890B气质联用仪 美国Agilent公司;57328-U型50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司。

1.2 试验方法

1.2.1 萃取头使用

初次使用萃取头时需在GC进样口以270 ℃老化2 h,以后使用前将萃取头在270 ℃活化30 min后即可。相同条件下做数次空白直至无干扰峰出现。

1.2.2 HS-SPME条件

精确称取不同部位美味牛肝菌样品(0.500 g)于20 mL棕色顶空瓶中,迅速将已老化好的萃取头插入顶空瓶中进行吸附,待吸附结束后迅速将萃取头拔出并插入到进样口进行解吸和检测。

图2为污水流速对水侧换热系数的影响.从图上可知，污水流速为0.2 m/s对水侧换热系数的影响很大，换热系数由4 368增大到5 545 W/m2·K，增大约27%，而后当污水流速再增大到0.25 m/s，水侧换热系数约6 048 W/m2·K，增大为仅9%.说明从0.2 m/s后，污水速度提高对水侧换热系数影响趋势不太明显.

1.2.3 GC-MS分析

GC-MS条件:HP-5MS 挥发性色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气(He)流速为1.0 mL/min;升温程序:初始温度40 ℃并保持5 min,然后以5 ℃/min升温至260 ℃保持2 min;不分流模式进样;进样口温度为250 ℃。质谱条件:EI源,70 eV,传输线温度250 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,扫描方式为全扫描,质量扫描范围30～400 m/z。

检测后经NIST Library 14.0谱库检索,并结合相关文献确定其成分组成,采用相似度大于80(最大值100)的检测结果。

1.2.4 单因素试验

在前期预试验的基础上,选择解吸时间15 min,单因素试验如下:固定萃取时间30 min、平衡时间20 min,研究不同温度(70,75,80,85,90 ℃)对挥发性风味物质萃取效果的影响;固定萃取温度80 ℃、平衡时间20 min,研究不同萃取时间(20,25,30,35,40 min)对挥发性风味物质萃取效果的影响;固定萃取温度80 ℃、萃取时间20 min,研究不同平衡时间(10,15,20,25,30 min)对挥发性风味物质萃取效果的影响。

1.2.5 响应面设计

根据Box-Behnken试验中心组合设计的原理,选择萃取温度、萃取时间及平衡时间为影响因素,各因素及水平表见表1。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.6 数据处理

每个试验均重复3次，响应面试验结果采用Design Expert 8.0.6软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 响应面试验优化

表2 响应面试验设计和结果Table 2 Design and results of response surface test

利用软件Design Expert 8.0.6对试验所得数据进行多元回归分析,获得美味牛肝菌挥发性风味物质对萃取温度(A)、萃取时间(B) 及平衡时间(C)的二次多项回归模型,回归方程为Y=29.40-0.87A-1.50B-0.88C+AB-1.25AC+1.50BC-3.08A2-1.83B2-2.07C2。

对回归模型及各因素进行方差分析,结果见表3。

表3 响应面试验回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation ofresponse surface test

续 表

由表3可知,模型的P值<0.000 1,说明回归模型极显著(P<0.01),而失拟项的P=0.367 8,不显著(P>0.05),表明回归方程拟合度良好。模型决定系数R2=0.981 4,RAdj2=0.957 5,表明回归方程与实际值具有高度拟合性,可以用此模型来对HS-SPME-GC-MS法萃取美味牛肝菌的挥发性风味物质进行分析和预测。另外,模型中的一次项A、B、C,交互项AC、BC及二次项A2、B2、C2对挥发性风味物质萃取效果的影响极显著(P<0.01),交互项AB对萃取效果的影响显著(P<0.05)。3个因素对挥发性风味物质峰数(Y)影响效果的主次顺序依次为萃取时间(B)>萃取温度(A)=平衡时间(C),因素两两交互作用的响应面结果见图1。

图1 萃取温度、萃取时间、平衡时间两两交互作用对挥发性风味物质萃取效果的影响Fig.1 Effects of interaction of extraction temperature, extraction time and equilibrium time on extraction effect of volatile flavor substances

对回归模型进行预测得到HS-SPME-GC-MS法分析美味牛肝菌挥发性物质的最佳条件为萃取温度79.05 ℃、萃取时间27.88 min、平衡时间23.42 min，预测美味牛肝菌挥发性物质峰个数为30.04个。

2.2 模型验证

根据实际条件对响应面试验模型进行修正并验证，选择萃取温度79 ℃、萃取时间28 min及平衡时间23 min，在此条件下最终得出美味牛肝菌伞部挥发性风味物质共31种，与预测值相差0.03%，表明此数学模型有着良好的预测性和准确性。

2.3 美味牛肝菌挥发性风味物质分析

采用最优的HS-SPME条件分别对70 ℃恒温干燥、70 ℃真空干燥及真空冷冻干燥后伞部、柄部挥发性风味物质进行GC-MS分析，经80%以上相似度筛选，结果见表4。

表4 不同干燥条件下美味牛肝菌伞部、柄部挥发性风味物质Table 4 The volatile flavor substances of pileuses and stipes of Boletus edulis Bull. under different drying conditions

续 表

由表4可知,通过HS-SPME-GC-MS技术共鉴定出挥发性风味物质51种,其中醇类10种,醛类13种,酮类13种,酸类1种,酯类5种,含硫、含氮及杂环类化合物8种,烯类1种。对不同部位的挥发性风味物质分析后发现,伞部共检测出43 种化合物,其中醇类9种,醛类11种,酮类11种,酸类1种,酯类3种,含硫、含氮及杂环类化合物7种,烯类1种。柄部共检测出40种化合物,其中醇类7种,醛类12种,酮类11种,酸类1种,酯类3种,含硫、含氮及杂环类化合物6种。

通过比较3种不同方法干燥的美味牛肝菌伞部及柄部挥发性风味物质发现,真空冷冻干燥方法无论是种类还是峰面积都是最好的,伞部有31种挥发性风味物质,峰面积为17.83×106;柄部有27种挥发性风味物质,峰面积为16.72×106。恒温干燥法鉴定出伞部有26种挥发性风味物质,峰面积为8.29×106;柄部有26种挥发性风味物质,峰面积为13.90×106。真空恒温干燥鉴定出伞部有22种挥发性风味物质,峰面积为13.28×106;柄部有20种挥发性风味物质,峰面积为9.37×106。

2.3.1 醇类化合物

醇类化合物在新鲜食用菌中含量非常丰富, 但因其挥发性强、稳定性差, 在加热过程中会造成一定的损失[18]。3种不同干燥方法共鉴定出醇类化合物13种,其中伞部有11种,柄部有9种。真空冷冻干燥后鉴定出的醇类化合物有10种,恒温干燥后鉴定出醇类化合物有8种,真空干燥后醇类化合物数量明显减少,只有2种。峰面积最大的是1-辛烯-3-醇,其次是反-2-辛烯-1-醇、橙花叔醇、苯乙醇、3-苯丙醇、正辛醇、1-壬醇、乙醇、正己醇、正戊醇。

2.3.2 醛类、酮类化合物

醛类、酮类是食用菌中较为丰富的挥发性风味物质,C5～C9醛类具有脂香气味,酮类具有浓郁花果香气[19-20]。3种不同干燥后的样品共鉴定出醛类13种,酮类13种,其中70 ℃恒温干燥后柄部醛类物质最多,共11种,70 ℃真空干燥后伞部、柄部醛类物质最少,均为7种。6种样品中,异丁醛、异戊醛、2-甲基丁醛、苯甲醛及苯乙醛是共有的醛类,其中异戊醛峰面积最大,其次是苯甲醛、苯乙醛、2-甲基丁醛和异丁醛。异戊醛存在于巧克力、可可、咖啡等食品中,广泛用于食用香精的配方中[21-22]。

在检测出的酮类化合物中,2,3-戊二酮和2-十一酮是共有的酮类,且以2-十一酮的峰面积最大。2,3-戊二酮是一种奶香型香料,广泛用于食用香料的制备[23]。2-十一酮具有柑橘类、油脂和芸香香气,存在于云香草、椰子油和棕榈油中[24]。

2.3.3 酸类、酯类化合物

酸类一般具有腥臭味,对风味具有不良的影响[25],通过对3种不同方式干燥后的伞部和柄部都发现含有乙酸。酯类多具有水果和陈酒的香味,对风味的贡献较大[26]。真空冷冻干燥后的伞部有3种酯类,包括丙烯酸正丁酯、甲酸辛酯和异丁酸-3-苯基丙酯,70 ℃真空干燥柄部有3,7-二甲基-6-辛烯醇丁酸酯和亚油酸乙酯,其他干燥后的不同部位含酯类物质很少。

2.3.4 其他

除了醇类、醛酮类、酸类及酯类化合物外,不同方式干燥后的美味牛肝菌中还鉴别出含硫化合物、含氮化合物、杂环类化合物及月桂烯等。含硫化合物包括甲硫醇、甲硫醚、3-甲硫基丙醛,含氮化合物包括2-乙酰基吡咯,杂环类化合物包括2-戊基呋喃、2-甲基四氢呋喃-3-酮、呋喃酮及异雪松醇。

2.3.5 八碳化合物和含硫化合物

八碳化合物是食用菌最重要的风味物质,主要有1-辛烯-3-醇(蘑菇醇)、1-辛醇-3-酮、3-辛酮、3-辛醇及1-辛醇等[27]。由表4可知,不同方式干燥后美味牛肝菌伞部和柄部共检测出的八碳化合物有7种,包括1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯-1-醇、正辛醇、1-辛烯-3-酮、3-辛酮、3-辛烯-2-酮、仲辛酮,其中醇类3种,酮类4种。峰面积最大的是1-辛烯-3-醇,其次是反-2-辛烯-1-醇。Murahashi最早在1938 年发现了松茸(Tricholomamatsutake)中的1-辛烯-3-醇,并将其命名为松茸醇,目前,几乎在所有的食用菌中都发现了1-辛烯-3-醇[28]。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、湿木头、泥土的气息[29],在真空冷冻干燥后伞部的相对含量最大,可达25.49%。反-2-辛烯-1-醇也具有蘑菇味[30],在真空冷冻干燥后的伞部、恒温干燥后的柄部及真空干燥后的伞部被鉴定出来。

含硫化合物对食用菌整体的芳香气味而言举足轻重,并且是香菇中非常重要的香味来源。然而,关于不同干燥方式对美味牛肝菌不同部位含硫化合物的影响还未见报道。通过对干燥后美味牛肝菌不同部位进行分析,共鉴定出3种含硫化合物,分别是甲硫醇、甲硫醚和3-甲硫基丙醛,其中以3-甲硫基丙醛的峰面积最大。3-甲硫基丙醛具有浓烈洋葱、肉及烤马铃薯的香气,低浓度时呈愉快的浓郁的肉香味,在香料工业中应用十分普遍[31]。甲硫醇是重要的有机化工原料,也是我国允许使用的食用香料。

3 结语

在单因素试验结果的基础上,通过HS-SPME-GC-MS联用技术结合响应面优化得到美味牛肝菌中挥发性风味物质的萃取条件为萃取温度79 ℃、萃取时间28 min、平衡时间23 min,在此条件下检测出真空冷冻干燥后美味牛肝菌伞部挥发性风味物质共31种,验证试验结果表明,利用HS-SPME-GC-MS 技术萃取美味牛肝菌中挥发性风味物质的方法可靠性高。对美味牛肝菌不同干燥方式处理后的伞部、柄部挥发性风味物质进行分析发现,匹配度大于80的挥发性风味物质共51种,其中醇类10种,醛类13种,酮类13种,酸类1种,酯类5种,含硫含氮及杂环类化合物8种,烯类1种。不同干燥方式对美味牛肝菌伞部、柄部挥发性风味物质的影响也不同,就伞部而言,真空冷冻干燥后鉴定出的挥发性风味物质有31种,峰面积为17.83×106,均远高于70 ℃恒温干燥(峰数26个,峰面积8.29×106)和70 ℃真空干燥(峰数22个,峰面积13.28×106)。对柄部而言,真空冷冻干燥后挥发性风味物质有27种,峰面积为16.72×106,也高于70 ℃恒温干燥(峰数26个,峰面积13.90×106)和70 ℃真空干燥(峰数20个,峰面积9.37×106)。总之,真空冷冻干燥处理能够较好保存美味牛肝菌的挥发性风味物质。云南有丰富的美味牛肝菌资源和广阔的消费市场,后期试验还需进一步研究其他干燥方式及干燥条件对美味牛肝菌挥发性风味物质的影响,通过对比分析以期获得美味牛肝菌更为经济适用的干燥方式。

综上所述,不同干制方法下美味牛肝菌伞部、柄部挥发性风味物质的组成及含量有着较大的差异,也代表着不同的食品风味。以营养丰富、风味独特的美味牛肝菌为原料,采用不同干制方法制备的调味料及复合调味料也一定会成为食用菌调味料的研发热点,有着广阔的市场发展前景。