宜宾芽菜源耐高盐植物乳杆菌LPYC-4冻干发酵剂的优化

陈俊宏，周雨浓，罗素琴，杨强，王洋，叶阳*

(1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.四川宜宾碎米芽菜有限公司，四川 宜宾 644011)

宜宾芽菜是川南地区的著名特产，以其“鲜、香、嫩、 脆”的独特风味深受大家喜爱，是川菜中的重要原料，畅销国内外。宜宾芽菜传统工艺[1]采用的是自然发酵，微生物在高盐条件下受到抑制，使得产品发酵风味不足；其发酵周期长、产品质量不稳定[2]，这些都严重制约着宜宾芽菜产业的发展。近年来，众多专家学者[3-4]提出选育优良的乳酸菌菌株代替自然发酵，既能有效缩短芽菜发酵周期，同时使发酵风味更加浓郁，使芽菜的产品质量更突出。纯种发酵[5-6]相比于传统发酵工艺，标准化程度更高，能更大程度上满足工业化的生产需求。

植物乳杆菌是宜宾芽菜发酵过程中的优势菌株，在赋予芽菜发酵风味和独特口感方面起着关键作用。乳酸菌菌株在实际保藏过程中会出现菌体失活[7]、发酵能力下降等问题，难以适应工业化的生产需要。直投式乳酸菌发酵剂稳定性强、容易保存，并且具有发酵菌粉活力高、直接投放使用、成本低、生产方法简单等优点，被广泛应用到生产生活中。但目前关于发酵剂的工业化应用研究还主要集中在泡菜生产[8]、乳制品加工[9]等行业，在宜宾芽菜等传统行业中的应用还未见报道。研究表明,真空冷冻干燥技术可维持乳酸菌的活力和储藏过程中的长期稳定性[10]，而糖类[11]、蛋白质、氨基酸和醇类等冷冻保护剂[12]可有效提高乳酸菌的冻干抗逆性，降低菌体损伤。康娇等[13]将泡菜中分离得到的发酵乳杆菌FYa1在海藻糖8.5 g/dL、蔗糖 8.5 g/dL和谷氨酸钠2.5 g/mL的最佳配比下制备的冻干菌粉存活率可达(68.53±0.09)%，并具有良好的发酵性能。发酵剂的保护配方由于乳酸菌的生理特性不同而有所差异[14]，呈现出不同的保护效果。赵爽等[15]利用植物乳杆菌P158在海藻糖7%、蔗糖7%、谷氨酸钠5%的条件下，制备泡菜用发酵剂的冻干存活率达到75.6%。保护剂能减少低温干燥过程中对菌体细胞物理、化学损伤或复水时对细胞的损害[16]，保持细胞中多种生物活性和理化特性，从而保证发酵剂中菌体活力。众多研究表明[17-18]，发酵剂在实际的生产应用中能很大程度上改善传统自然发酵产品的质量[19]，增强产品的风味[20]，在工业化生产中具有巨大的应用前景。

从宜宾芽菜中分离得到的植物乳杆菌耐盐性可达到12%，亚硝酸盐降解能力可达到97.54%以上，具有优良的产酸性能，本研究以LPYC-4菌株为研究对象，利用真空冷冻干燥方法从6种不同的保护剂中筛选出合适的冻干保护剂，并对其配方进行优化，制备高活力的植物乳杆菌发酵剂。本文旨在开发一种发酵活力高、亚硝酸盐降解能力强、稳定性高的芽菜发酵剂，对提高宜宾芽菜产品发酵质量、宜宾芽菜的工业化生产起到促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株

耐高盐乳酸菌LPYC-4菌株：分离自宜宾传统芽菜，四川轻化工大学生物工程学院食品实验室保存。

1.1.2 试剂

甘油：成都市科隆化学品有限公司；山梨糖醇、谷氨酸钠、甘氨酸：国药集团化学试剂有限公司；脱脂乳粉：上海源叶生物科技有限公司；海藻糖：博美生物科技有限公司；MRS肉汤、MRS固体培养基：青海海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

NanoDrop One型超微量分光光度计 赛默飞世尔科技公司；Scientz-10N型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；TG16G型离心机 盐城市凯特实验仪器有限公司；HWS-250B型恒温培养箱 天津市宏诺仪器有限公司；ZDJ-4A型自动电位滴定仪 上海精科有限公司；QYC-2102C型双层小容量全温恒温培养摇床 上海福玛实验设备有限公司；UV-1900i型紫外可见分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 生长曲线测定

将活化后的耐高盐植物乳酸菌LPYC-4菌株按2%的比例接种到MRS培养液中30 ℃恒温摇床培养，测定其在48 h内的OD600 nm值，每隔2 h测定一次，绘制生长曲线。

1.3.2 pH值测定

将活化后的耐高盐植物乳酸菌LPYC-4菌株按2%的比例接种到MRS培养液中30 ℃恒温摇床培养，测定其在48 h内的pH值，每隔2 h测定一次，绘制pH变化曲线，pH值采用精密pH计测定。

1.3.3 乳酸菌冻干试验流程及操作要点

菌株活化→扩大培养→离心收集菌体→菌体悬液(加入冻干保护剂溶液)→分装→预冻→真空冷冻干燥→冻干菌粉→复水→活菌计数→计算存活率。

保护剂溶液的配制：采用控制变量法将保护剂中的一种或几种按照各自的质量浓度用蒸馏水溶解，搅拌均匀，于110 ℃灭菌15 min，通过孔径为0.22 μm的滤膜除菌，置于4 ℃冰箱中保存备用。

将活化2次后的乳酸菌，按照体积分数为2%的接种量接种到MRS肉汤培养基中扩大培养，置于37 ℃、150 r/min摇床中恒温培养24 h。将发酵液分装后，在转速为6 000 r/min离心条件下离心15 min，倒掉上清液，再用质量分数为0.9%的生理盐水冲洗2次后，离心得到菌泥。加入原发酵液体积1/10的保护剂溶液，混匀得到菌悬液，按照稀释涂布平板法接种到MRS固体培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养48 h，计算冻干前的活菌数(记为n1)，每组做3个平行。将制备好的菌悬液放入-20 ℃冷冻室12 h，进行预冷冻，使其冻结均匀；预冻结束后转移至真空冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50 ℃、真空度<15 Pa的条件下，真空冷冻干燥24 h，得到冻干菌粉。

1.3.4 冻干后的菌种存活率

向冻干后的乳酸菌粉中加入与冻干前等体积的生理盐水(质量分数为0.85%)进行复水，并稀释到合适的浓度，按照稀释涂布平板法接种到MRS固体培养基中，37 ℃恒温厌氧培养48 h，用平板计数法计数，每组做3个平行。冻干存活率计算公式如下：

式中：K为冻干存活率；n1为冻干前活菌数；n2为冻干后活菌数。

1.3.5 指标测定方法

1.3.5.1 乳酸菌活菌数测定

菌落计数参照GB 4789.35—2016中的方法，采用稀释梯度法。

1.3.5.2 菌悬液浓度测定

采用超微量分光光度计测定菌悬液在600 nm处的OD值。

1.3.6 单因素试验

采用单因素试验对甘油、山梨糖醇、脱脂乳粉、海藻糖、谷氨酸钠、甘氨酸6种保护剂进行筛选，按照1.3.3中所述方法进行冻干试验，以冻干存活率为依据，研究各种单一保护剂对植物乳酸菌LPYC-4存活率的影响。

1.3.7 发酵剂正交优化

根据单因素试验结果，选择脱脂乳粉、谷氨酸钠、海藻糖、甘氨酸4个因素中保护效果较好的3个水平，以乳酸菌的冻干存活率(K)为指标，设计了四因素三水平L9(34)正交试验，试验设计见表1。

表1 正交试验设计因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

1.4 发酵剂稳定性试验

将真空冷冻干燥后的乳酸菌冻干粉于4 ℃下冷藏保存，从第0天起，每隔10 d测定其活菌数，并计算菌体存活率。

1.5 数据处理分析

采用Excel、IBM SPSS Statistics 25.0进行数据处理分析，采用Origin 9.0进行图片处理制作。

2 结果与分析

2.1 耐高盐植物乳杆菌LPYC-4菌株生长曲线及pH测定

植物乳杆菌LPYC-4菌株生长曲线及pH见图1。

图1 植物乳杆菌LPYC-4菌株生长曲线及pH测定Fig.1 Strain growth curve and pH determination of Lactobacillus plantarum LPYC-4

由图1可知，植物乳杆菌LPYC-4在0～4 h生长缓慢，菌株处于延滞期，在此期间内组间OD600 nm值无显著性差异(P>0.05)，培养基pH由5.86降低到5.6；4 h后进入对数生长期，在此期间菌体细胞迅速生长，OD600 nm值差异性显著(P<0.05)；24 h时发酵液中菌体浓度达到3.59×108CFU/mL，培养基pH迅速下降到3.96，菌株开始进入稳定期，在此期间LPYC-4菌株繁殖极少，曲线基本保持稳定状态，菌株产酸能力也开始减弱；培养46 h后培养基pH稳定在3.71左右，与忻晓庭等[21]的研究结果相一致。由于菌种在对数生长末期生理结构和代谢功能处于稳定期，此时的菌体抗逆性更强[22]，因此选择扩大培养22～24 h内的LPYC-4菌株作为冻干发酵剂的研究对象更为有利。

2.2 不同保护剂对菌株存活率的影响

2.2.1 不同谷氨酸钠浓度对菌株存活率的影响

真空冷冻干燥法制备乳酸菌发酵剂的过程中，由于环境温度骤降会导致微生物生理代谢异常，通过向菌悬液中添加合适的冻干保护剂可以有效降低菌株抵抗外界环境改变对菌种产生的不可逆损伤[23]，提高菌株的存活率。

图2 不同谷氨酸钠浓度对于LPYC-4菌株冻干存活率的影响Fig.2 Effect of different sodium glutamate concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由图2可知，当以谷氨酸钠为冻干保护剂时，对植物乳杆菌LPYC-4的保护效果比较明显。当谷氨酸钠的浓度为10%时，植物乳杆菌LPYC-4的存活率最高，可达到55.75%；当浓度在6%～10%时，随着浓度的增加，菌体的存活率不断上升，菌种受冻干的影响在不断减小；当浓度大于10%时，谷氨酸钠浓度的增加对菌体的保护效果不再增大，植物乳杆菌LPYC-4的存活率基本保持不变(P>0.05)，其影响规律与郝倩男等[24]的研究结果相一致。类似的研究发现，当最优配方中谷氨酸钠的质量浓度为15.0 g/dL时，对乳酸菌株686的保护作用最好，菌体存活率最高，可达76.78%。由此可见，谷氨酸钠是用于制备乳酸菌发酵剂的较好基质，谷氨酸钠在进入细胞后，会通过自身携带的氨基与细菌蛋白质的羧基发生缩合反应，提高蛋白质空间结构的稳定性，从而提高了菌体适应外界极端环境的能力[23]。综合考量，选择10%谷氨酸钠作为乳酸菌发酵剂的冻干保护剂，进行发酵剂配方的优化。

2.2.2 不同脱脂乳粉浓度对菌种存活率的影响

脱脂乳粉是制备益生菌微生态制剂时广泛使用的保护壁材，其中的乳清蛋白可以使菌体微胶囊化[25]，避免其暴露于外界环境中，从而可以降低冷冻干燥过程中对细胞造成损伤。其中含有的乳清蛋白可以为细胞提供保护性外膜，保护细胞免受外界干扰而造成损伤。

图3 不同脱脂乳粉浓度对LPYC-4菌株冻干存活率的影响Fig.3 Effect of different skimmed milk powder concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由图3可知，当脱脂乳粉浓度在10%～14%时对乳酸菌的存活率影响不大，当脱脂乳粉浓度为16%时出现峰值，最高存活率为56.52%；当浓度高于16%之后，乳酸菌的冻干存活率呈现急剧下降的趋势，高浓度的保护剂会抑制菌体的生长，原因可能是高浓度的脱脂乳粉降低了细胞膜的流动性，阻碍了菌体与外界的物质交流[26]。研究发现脱脂乳粉15.98 g/dL的条件下植物乳杆菌L12菌体的存活率为83.66%[27]，由此可见，脱脂乳粉在保证植物乳杆菌的存活率方面具有较好的作用。其次，脱脂乳粉作为保护剂，可提供多孔无定形结构，冷冻干燥后易于成形，对菌剂颗粒的分散性较好，组织形态较完整，复水更容易，更利于应用于生产中作为乳酸菌发酵剂的良好赋形剂[28]。

2.2.3 不同甘油浓度对菌种存活率的影响

不同甘油浓度下植物乳杆菌LPYC-4经冷冻干燥后的存活率见图4。

图4 不同甘油浓度对LPYC-4菌株冻干存活率的影响Fig.4 Effect of different glycerol concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由图4可知，当甘油浓度较低时，植物乳杆菌的存活率随着甘油浓度的增加而小幅度提高，当甘油浓度超过9%时，植物乳杆菌的冻干存活率开始下降。甘油对植物乳杆菌LPYC-4的冻干存活率在8.45%～28.78%范围内，其最高峰值出现在甘油浓度为9%时，植物乳杆菌的冻干存活率达到28.78%。此外，研究发现甘油作为单一保护剂时对嗜热链球菌M5-5的冻干存活率为47.51%。由此可见，甘油在冻干条件下对植物乳杆菌LPYC-4的保护作用有限。甘油等渗透性化合物的保护机制是透过细胞膜取代部分水分子与菌体蛋白质极性基团形成氢键，使菌体中的大分子物质在缺水状态下仍能保持原有的功能结构，维持菌体活力[29]，但当细胞环境中水分损失完全时，甘油与水分子结合的程度降低，对细胞的保护作用减弱。综合分析，甘油不适合作为冻干保护剂制作植物乳杆菌LPYC-4发酵菌粉。

2.2.4 不同海藻糖浓度对菌种存活率的影响

图5 不同海藻糖浓度对LPYC-4菌株冻干存活率的影响Fig.5 Effect of different trehalose concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由图5可知，随着海藻糖浓度的增加，乳酸菌的存活率呈现不断增加的趋势，当海藻糖浓度为4%时，乳酸菌存活率最高，为64.0%；之后乳酸菌的存活率开始递减，当海藻糖浓度为6%时，存活率降为41.38%。对比可以发现，海藻糖对乳酸菌的保护效果较好。研究发现当海藻糖质量浓度为6.0 g/mL时，乳酸菌存活率最高，可达到74.69%。研究发现植物乳杆菌菌株 P158冻干保护剂为海藻糖7%、蔗糖7%、谷氨酸钠 5%时，菌株冻干存活率可达75.60%，且活菌数能达到7.32×1011CFU/g。众多研究发现[30-32]，海藻糖对乳酸菌具有良好的保护效果，可提高乳酸菌的存活率，适合作为微生物的冻干保护剂使用。同时海藻糖比蔗糖具有更高的玻璃化温度[33]，在细胞内形成玻璃态而不形成冰核，具有极强稳定性的非还原性双糖，极端条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，可有效维持生物膜、蛋白质、淀粉等各种生物组织和生物大分子的稳定性[34]。试验过程中发现，若添加糖类保护剂的浓度过高，冻干后的样品质地较硬且不易粉碎成粉剂，因此综合考虑实际应用及成本费用等因素，最终选择4%的海藻糖进行发酵剂配方优化。

2.2.5 不同甘氨酸浓度对菌种存活率的影响

当甘氨酸作为冻干保护剂时，植物乳杆菌LPYC-4的冻干存活率随甘氨酸浓度的变化见图6。

图6 不同甘氨酸浓度对LPYC-4菌株冻干存活率的影响Fig.6 Effect of different glycine concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由图6可知，植物乳杆菌LPYC-4的冻干存活率随着甘氨酸浓度的增加而不断提高，当甘氨酸浓度为5%时存活率最高，为68.24%，随后甘氨酸浓度继续增加，菌体的冻干存活率开始下降。研究表明，氨基酸可通过维持冰点下水的表面张力平衡细胞内外的水交换速率，降低冰晶对细胞的机械损伤。甘氨酸通过与细胞膜上的特异性受体结合[35]，改变了细胞膜的流动性，从而提高了细胞在冷冻干燥条件下的抗逆性，保证乳酸细胞的存活率。由此可见，甘氨酸浓度在5%左右能使植物乳杆菌LPYC-4细胞活性维持在较高水平。

2.2.6 不同山梨糖醇浓度对菌种存活率的影响

山梨糖醇多被用作冻干保护剂[36]，山梨糖醇具有多个羟基，能与菌体细胞膜的自由基通过水合作用降低游离水含量，减少低温下晶核的形成，稳定磷脂双分子层和膜蛋白结构，增加细胞的稳定性，从而起到保护作用。

图7 不同山梨糖醇浓度对LPYC-4菌株冻干存活率的影响Fig.7 Effect of different sorbitol concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由图7可知，当山梨糖醇浓度在9%～12%范围内时LPYC-4菌株经过冷冻干燥后的存活率随着浓度的增加而升高，当浓度为12%时，菌体的存活率出现峰值，为52.74%；当山梨糖醇浓度超过12%时，对菌体的保护作用开始减弱。其他研究也发现山梨糖醇对LP-7501S乳酸菌菌株具有较好的保护作用。蒋文鑫等[37]研究发现山梨糖醇在棉子糖与胶原蛋白等组成的冻干保护剂下，对短双歧杆菌的保护作用接近80%，由此可推断山梨糖醇对乳酸菌的保护作用较好。

2.3 植物乳杆菌LPYC-4冻干发酵剂配方优化

研究表明，多种保护剂混合使用对菌体的保护效果优于单一的保护剂。根据单因素试验筛选结果，以植物乳杆菌LPYC-4的冻干存活率(K)为指标，采用正交试验优化冻干发酵剂配方，正交试验设计及结果见表2。

表2 植物乳杆菌LPYC-4冻干发酵剂正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test design and results of Lactobacillus plantarum LPYC-4 lyophilized starter

由表2可知，4种保护剂对植物乳杆菌LPYC-4的极差R分别为7.36，2.56，8.45，26.80，其大小顺序为RD>RC>RA>RB，极差越大表明该因素对菌体存活率的影响越显著。因此，4种保护剂对植物乳杆菌LPYC-4冻干存活率的影响主次顺序为甘氨酸>海藻糖>脱脂乳粉>谷氨酸钠。

表3 植物乳杆菌LPYC-4发酵剂配方正交试验方差分析结果Table 3 Results of variance analysis of orthogonal test forLactobacillus plantarum LPYC-4 starter formula

由表3方差分析结果可知，甘氨酸、海藻糖、脱脂乳粉3种保护剂对植物乳杆菌LPYC-4冻干存活率的影响极显著(P<0.01),谷氨酸钠对植物乳杆菌LPYC-4冻干存活率的影响不显著(P>0.05)。因此，由k值可知，植物乳杆菌LPYC-4发酵剂的最佳组合为A2B2C3D3，即脱脂乳粉16%，谷氨酸钠10%，海藻糖5%，甘氨酸6%。

2.4 发酵剂优化验证结果

植物乳杆菌LPYC-4保护剂的最优的配方水平是A2B2C3D3。因此，以脱脂乳粉16%、谷氨酸钠10%、海藻糖5%、甘氨酸6%为发酵剂配方，在真空冷冻干燥下冻干后，经过3次重复试验测得植物乳杆菌LPYC-4菌株的冻干存活率为(77.78±2.90)%，高于所有正交试验组的存活率，且冻干发酵剂的活菌数约为2.01×1010CFU/g。

2.5 贮藏稳定性

发酵剂在长期贮藏过程中的生物浓度和稳定性对发酵剂的实际生产应用具有重要意义。按照正交优化后的发酵剂配方制备植物乳杆菌LPYC-4发酵剂，经过真空冷冻干燥机冻干后在4 ℃条件下保存。

图8 植物乳杆菌LPYC-4发酵剂的贮藏稳定性Fig.8 Storage stability of Lactobacillus plantarum LPYC-4 starter

由图8可知，随着保存时间的增加，发酵剂活菌数呈现不断下降的趋势。在保藏2个月后，发酵剂中菌体细胞的存活率为(61.37±2.5)%，含有的活菌数为3.20×109CFU/g，保持较高的活菌数。Lee等[38]发现LactobacillusplantarumJH287在含10%山梨糖醇和10%脱脂乳粉的保护剂中4 ℃保藏2个月后，菌体存活率可达77.71%。Gul等[39]研究发现L.curvatusN19在保护剂配方为脱脂乳粉20 g/dL、乳糖3.57 g/dL、蔗糖10 g/100 g条件下，4 ℃下贮存6个月仍能保持菌体活性在8.85 log CFU/g，具有良好的稳定性。通过对比发现，此配方下发酵剂的贮藏稳定性较差，与Lee等的研究还存在一定的差异，其原因可能与所用菌种的生理特性有关。因此，还需要进一步优化发酵剂的配方以提高植物乳杆菌LPYC-4在实际保藏过程中菌株活力的稳定性。

3 结论

研究表明，添加不同类型的保护剂可有效改善菌体冻干微环境，缓解菌株冻干损伤，提高抗冻性能。通过单因素试验筛选出甘氨酸、海藻糖、脱脂乳粉、谷氨酸钠4种对植物乳杆菌LPYC-4具有较好保护效果的冻干保护剂，并利用正交试验优化发酵剂配方。其最佳配方组合为脱脂乳粉16%、谷氨酸钠10%、海藻糖5%、甘氨酸6%，在此条件下经过冷冻干燥得到活性较高的发酵剂，植物乳杆菌LPYC-4冻干存活率为(77.78±2.90)%，活菌数约为2.01×1010CFU/g。在贮藏稳定性试验中，优化发酵剂配方后的植物乳杆菌LPYC-4在4 ℃条下保藏2个月后，菌体细胞的存活率仍能达到(61.37±2.5)%，含有的活菌数为3.20×109CFU/g，保持较高的活菌数。以上研究为改进传统宜宾芽菜发酵工艺，提高宜宾芽菜产品发酵质量，推进芽菜强化发酵工艺的工业化应用起到了积极的促进作用。