生姜汁对LPS诱导肺炎小鼠肠道菌群的调节作用

刘子铭，王文静，朱鹏超，朱锦璐，丁宇航，韩明洋，王晓龙,2

(1山东中医药大学，济南 250355;2山东中医药大学实验中心，济南 250355)

急性肺损伤(ALI)是临床常见的呼吸系统疾病[1]，目前研究主要在与ALI的发展和进展有关的血浆和分子生物标志物上，但因其发病机制较为复杂，目前治疗效果尚不理想。研究发现，肠道菌群失调能够诱导多种疾病产生[2-3]，而肺部疾病也会导致肠道菌群的失调，进而影响肠黏膜结构与功能[4]。生姜汁(ZOS)可以调节肠道菌群结构、丰富菌群丰度、增加菌群多样性，以缓解炎症、恢复肠道微环境[5-6]。因此，本研究基于16S rDNA技术，探讨ZOS对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤小鼠肠道菌群影响，进而分析肠道菌群对急性肺损伤的影响。

1 材料

1.1 实验动物

取SPF 级Balb/c雄性小鼠，6～8 w龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0006。饲养于山东中医药大学 SPF 级动物房，观察小鼠生长情况，按时更换垫料、饲料及饮用水。本实验经山东中医药大学医学与实验动物伦理委员会审查通过。

1.2 药物与试剂

ZOS(自制，由鲜生姜榨汁后，进行过滤制备而成)；异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，货号R510-22-16)；LPS(美国sigma公司，货号L2880)；磷酸盐缓冲液(PBS)(上海源培生物科技股份有限公司，货号B310KJ)。

1.3 仪器

电子天平(EX225ZH/AD)，奥豪斯仪器有限公司；榨汁机(型号KP60SB),广东科嘉霖电器制造有限公司；增强型小动物麻醉机(型号R540IE),深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Illumina MiSeqPE300测序平台,由上海美吉生物医药科技有限公司提供。

2 方法

2.1 ZOS制备

取适量新鲜生姜，去皮洗净，切成小块，加入适量生理盐水榨汁，4层纱布过滤，制成3 g/mL的ZOS，每日现榨现用。

2.2 动物分组及给药

将Balb/c小鼠按体重分为对照组、LPS模型组、ZOS组。ZOS组通过灌胃方式给予ZOS 3 g/mL，对照组、LPS模型组灌胃生理盐水，连续灌胃给药14 d。

2.3 LPS诱导急性肺损伤小鼠模型建立

电子天平称取适量LPS粉末，以无菌PBS稀释为2.5 mg/mL，采用异氟烷呼吸麻醉的方式将小鼠麻醉，对照组小鼠鼻腔滴入20 μL生理盐水，其余组小鼠鼻腔滴入2.5 mg/mL的LPS 20 μL，完成造模。

2.4 粪便收集及肠道菌群检测

实验动物造模后禁食不禁水12 h。轻轻抓握小鼠刺激排便，并迅速用无菌EP管接取粪便，每只小鼠取2粒，迅速转移至-80 ℃保存。获得粪便样本共15个，每组5个，DNA提取及Illumina Miseq PE300测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

2.5 肺指数

小鼠取粪便后处死，摘取全肺，剔除结缔组织，万分之一电子天平称定质量并计算肺指数(肺重/体重)。

2.6 测序分析

测序数据通过美吉公司云平台微生物多样性QIIME2流程进行分析。根据扩增子序列变异(ASV)对肠道菌群进行Alpha 多样性分析等。为研究不同样本间的差异关系，找出不同组间在丰度上的差异物种，进行 Beta 多样性、LEfSe 分析等。

2.7 统计学分析

数据分析采用单因素方差分析，使用Graphpad Prism 8.0.2软件，P<0.05具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 ZOS对急性肺损伤小鼠肺指数的影响

相比于对照组，模型组肺指数显著升高(P<0.05)。与模型组相比，ZOS组肺指数明显下降(P<0.05)，表明给予ZOS后，可改善肺损伤情况(图1、附表)。

附表 ZOS对急性肺损伤小鼠肺指数的影响

图1 ZOS对急性肺损伤小鼠肺指数的影响

3.2 数据质控及ASV分析

粪便样本共15个，共获得优化序列710 298条，所测样本中最高序列条数55 641，最低序列条数36 286。使用DADA2方法降噪后共生成822个ASV，按样本最低序列条数进行抽平处理，得到822个ASV。在ASV水平上对不同样本间的异同进行统计，并通过Venn图展现不同样本之间共有或特有的ASVs。对照组ASV 506个、模型组ASV 584个、ZOS组ASV 556个，这提示，LPS感染小鼠菌群多样性升高，给予生姜汁治疗后，小鼠菌群多样性降低；对照组与模型组非共有的ASV 340个，表明LPS感染小鼠粪便菌群组成发生显著变化；ZOS组与模型组非共有ASV 358个，对照组与ZOS组非共有ASV 334个，表明给予ZOS后可以降低粪便菌群多样性(图2)。

图2 各组菌群的ASV分布

3.3 Alpha多样性分析

3.3.1 稀释性曲线分析 随机抽取样本，计算并作图，其中 X 轴代表每个样本随机抽取的序列条数、Y 轴代表Sobs指数，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合适。图3结果表明，每个样本随机抽取的序列条数与Sobs指数曲线均趋向于平坦状态，表明各组小鼠粪便样本取样数量合理。

图3 稀释性曲线分析图

3.3.2 Alpha多样性指数分析 相比于对照组，模型组群落丰富度有上升趋势；而相比于模型组，ZOS组群落丰富度下降。结果提示，ZOS具有改善急性肺损伤小鼠肠道菌群的多样性的作用(图4、图5)。

图4 Alpha多样性指数柱形图

图5 Alpha多样性指数组间差异检验箱式图

3.4 Beta多样性分析

3.4.1 PCA与PCoA分析 如图6所示，模型组与对照组、ZOS组距离均较远，认为模型组与其余2组的肠道菌群种类具有明显差异；并且ZOS组与对照组菌群结构距离相近，表明在给予ZOS治疗后，可明显改善急性肺损伤小鼠肠道内菌群，使之趋于正常。

图6 PCA与PCoA分析

3.4.2 Hcluster分析 图7结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肠道菌群发生明显变化，而ZOS可以改善急性肺损伤小鼠肠道菌群的结构，使之趋于对照组。

图7 UPGMA层次聚类分析图

3.5 物种分析

3.5.1 门水平(Phylum)物种组成分析 图8结果显示，各样本在门水平上相比，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)的菌群表现出较高的丰度。相比于对照组，LPS模型组肠道菌群中有2种菌群丰度有较为明显变化，厚壁菌门菌群丰度上升，拟杆菌门菌群丰度降低。而ZOS组中表现出与模型组截然相反的情况，厚壁菌门丰度降低，拟杆菌门菌群丰度上升。上述结果表明，ZOS可以改善LPS诱导急性肺损伤小鼠肠道中厚壁菌门和拟杆菌门的菌群丰度。

图8 粪便菌群门水平相对丰度图

3.5.2 目水平(Order)物种组成分析 图9结果显示，各组样品中主要包括7个目，分别是拟杆菌目(Bacteroidales)、乳螺目(Lachnospirales)、梭菌目UCG-014(Clostridia_UCG-014)、振螺目(Oscillospirales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、Clostridia_vadinBB60_group、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)，其中排名前4位的是拟杆菌目、乳螺目、梭菌目UCG-014和振螺目。与对照组相比，模型组小鼠中拟杆菌目、乳螺目菌群丰度降低，梭菌目和振螺目菌群丰度升高；给予ZOS后，小鼠粪便中拟杆菌目菌群丰度升高，梭菌目菌群丰度降低。

图9 粪便菌群目水平相对丰度柱状图

3.5.3 属水平(Genus)物种组成分析 图10结果显示，样本中细菌群落组成中包括的菌属有19种，分别为Muribaculaceae、Clostridia_UCG-014、Lachnospiraceae、乳杆菌属(Lactobacillus)、普雷沃氏菌属UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、拟杆菌属(Bacteroides)、毛螺菌属NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、Oscillospiraceae、另支菌属(Alistipes)、罗氏菌属(Roseburia)、Muribaculum、Oscillospiraceae、Lachnospiraceae、Clostridia_vadinBB60_group、Ruminococcaceae、理研菌科RC9_gut_group(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、嗜木聚糖真杆菌(Eubacterium_xylanophilum_group)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)。与对照组相比，模型组中Muribaculaceae、Lachnospiraceae、乳杆菌属、拟杆菌属、毛螺菌属NK4A136、Muribaculum、Lachnospiraceae、Lachnospiraceae、脱硫弧菌属菌群丰度有较为明显的下降趋势,Clostridia_UCG-014、拟普雷沃氏菌属、Oscillospiraceae、Eubacterium_xylanophilum_group菌群丰度有明显上升趋势。与模型组相比，ZOS组Muribaculaceae、Lachnospiraceae、普雷沃氏菌科UCG- 001、拟杆菌属、拟普雷沃氏菌属、Oscillospiraceae、Clostridia_vadinBB60_group、Ruminococcaceae菌群丰度有上升趋势,Clostridia_UCG-014、毛螺菌科NK4A136、罗氏菌属、Lachnospiraceae、嗜木聚糖真杆菌的菌群丰度有明显下降趋势，提示给予ZOS后，可明显改善急性肺损伤小鼠肠道菌群丰度，使之趋于对照组。

图10 粪便菌群属水平相对丰度图

3.5.4 Heatmap分析 菌群Heatmap分析结果表明，对照组与模型组菌群结构有明显不同，提示肺损伤可改变菌群结构，造成肠道菌群失调，与模型组相比，ZOS组小鼠的肠道菌群结构有所改善(图11)。

图11 水平菌群 Heatmap 分析

3.6 LEfSe分析

该方法设定 LDA 得分值>4找到组间丰富度存在显著差异的物种。图12结果表明，与对照组相比，模型组的差异物种主要为厚壁菌门、颤螺旋菌科(Oscillospiraceae)、Clostridia_UCG-014；与模型组相比，ZOS组差异主要表现在拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌门、拟杆菌目、Muribaculaceae、普雷沃氏菌科。

图12 LEfSe分析

4 讨论

生姜对肠道菌群具有多种调节作用。生姜提取物能显著抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等[7]菌群的繁殖。生姜中的6-姜酚对幽门螺杆菌具有显著抑制作用[8]。干姜对肠道菌群也具有调控作用[9]，如对肠杆菌的抑制作用、对肠道乳酸杆菌的促进作用等[10]。本研究通过小鼠滴鼻LPS构建急性肺损伤模型，造模后小鼠肺重及肺指数明显增加，肠道菌群多样性及丰度发生明显改变，Muribaculaceae、Lachnospiraceae、乳杆菌属、拟杆菌属、毛螺菌属NK4A136、Muribaculum、Lachnospiraceae、Lachnospiraceae、脱硫弧菌属菌群丰度明显下降，Clostridia_UCG-014、拟普雷沃氏菌属、Oscillospiraceae、Eubacterium_xylanophilum_group菌群丰度明显上升。经ZOS治疗后，小鼠的肺重、肺指数显著降低，肠道菌群的多样性及丰度有所改善，Muribaculaceae、Lachnospiraceae、普雷沃氏菌科UCG-001、拟杆菌属、拟普雷沃氏菌属、Oscillospiraceae、Clostridia_vadinBB60_group、Ruminococcaceae菌群丰度呈上升趋势,Clostridia_UCG-014、毛螺菌科NK4A136、罗氏菌属、Lachnospiraceae、嗜木聚糖真杆菌的菌群丰度有明显下降趋势，菌群结构更加稳定。提示调节肠道菌群可能是治疗肺损伤的方法之一。

肠道菌群在抵抗病原体，提高机体免疫功能方面能发挥重要作用[11-12]。肠-肺轴(GLA)具有复杂相互作用及局部和深远免疫效应的特点[13-14]。Muribaculaceae存在于小鼠肠道中涉及复杂的碳水化合物降解[15]，在降解碳水化合物方面发挥作用。Lachnospiraceae被认为在代谢性疾病[16]、肝脏疾病[17]、肾病[18]、肠炎[19]及与肠脑轴相关的肠胃失调疾病[20-21]中发挥重要作用。拟杆菌属与多种疾病发生有密切联系，如结肠炎[22]、结肠癌[23]等。本研究未明确的部分菌群仍需进一步验证。