F81细胞无血清悬浮驯化后培养猫泛白细胞减少症病毒的研究

张久鑫，邵宝顺，朱 辉，贾浩苒，梁 琳，汤新明，崔尚金，梁瑞英*，王龙涛*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100089；3.广东省华晟生物技术有限公司，广东广州 511300)

猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)又称猫细小病毒(Feline parvovirus)、猫瘟病毒、猫传染性肠炎病毒，属于细小病毒科、细小病毒属成员。该病毒在自然条件可以感染猫科、鼬科和浣熊科等多种动物，如豹、虎、浣熊、山猫、野猫、家猫、狮子、猞猁、水貂，体型较小的猫科动物以及水貂为主感染对象，能引起以高热、白细胞大量减少、呕吐以及肠炎为主要临床特征的病毒性传染病的病原体[1]。猫细小病毒的DNA复制在感染细胞的细胞核内进行，由于FPV存在复制能力的缺陷，必须依赖宿主细胞提供DNA聚合酶以及复制体系才能开始复制，因此，FPV的复制过程在细胞增殖的S期开始。所以，在进行细小病毒的分离培养或传代培养时，需在细胞刚接种时或最迟在24 h内就进行接种病毒，一般采取传代细胞同步接毒或40%～50%贴壁时再接毒的方法，该方法能提高FPV的分离成功率和病毒滴度，而不能等到细胞长满形成单层后才进行，否则无法达到分离或传代培养病毒的目的。 猫泛白细胞减少症病毒不仅能在心、肺、肠、肾、脾、睾丸、骨骼、肾上腺和淋巴结等组织细胞中复制，也能在多种不同类型的细胞系进行复制增殖，如猫肾细胞(feline kidney cells,F81)、猫肾细胞(crandell rese feline kidney cells,CRFK)、FK细胞、NLFK细胞、FLF细胞、犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cells, MDCK)和非洲绿猴肾细胞(Vero)等，F81细胞和CRFK细胞较为常用。

随着悬浮培养技术日趋成熟，利用生物反应器大规模生产生物制品成为共识，国内外相关技术发展迅速，其中国外发展历史较早，现多为人用生物制品研发[2]，对于兽用生物制品也有报道，如利用幼仓鼠肾细胞(baby hamster syrian kidney cells, BHK)生产口蹄疫疫苗[3]。国内一线生产用细胞基质越来越多，生物反应器规模越来越大[4]，这为国内生物制品发展带来了极大便利。伴随着细胞改造技术和个性化培养基技术的发展，国内细胞培养生物制品企业迎来了新机遇，现已有BHK悬浮细胞用于生产口蹄疫疫苗[5]，MDCK悬浮细胞代替鸡胚用于生产禽流感疫苗[6]，猪睾丸细胞(swine testis cells, ST)悬浮细胞用于生产猪伪狂犬病疫苗[7]。但用于猫病毒增殖的悬浮细胞系还鲜有报道，多停留在转瓶培养或实验室微载体培养阶段，距离规模化大生产还有一段距离。

本研究的目的是对F81细胞系进行无血清悬浮驯化，在无血清培养基中可以高密度生长，并能实现规模化培养。并以此作为细胞基质摸索猫泛白细胞减少症病毒悬浮培养工艺，达到疫苗生产要求。本研究将改善猫泛白细胞减少症疫苗培养工艺，提高产品质量，提升生产效益及核心竞争力，为宠物疾病预防提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、耗材和主要试剂 猫肾细胞(F81)、猫泛白细胞减少症病毒FPV-BJ05由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所宠物创新团队提供，其无菌检查、支原体检查及外源因子检查均符合《中国兽药典》三部(2020 版)相关规定；方瓶、摇瓶、冻存管、离心管，Corning公司产品；96孔板、MEM培养液、2.5 mg/mL胰蛋白酶、无血清悬浮培养基、胎牛血清，广州市小木虫生物科技有限公司产品。

1.1.2 主要仪器设备 生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司产品；CO2培养箱，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；水平摇床，苏州捷美电子有限公司产品；低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；倒置显微镜，广州市明美光电技术有限公司产品；细胞计数仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。

1.2 方法

采用逐步降低血清的方法将贴壁F81细胞血清浓度由100 mL/L降到20 mL/L；然后把血清浓度为20 mL/L的贴壁细胞经消化离心后加入无血清悬浮培养液培养，血清浓度不变；最后将悬浮细胞由低血清浓度驯化为无血清全悬浮培养状态。经过这三个阶段的驯化后，得到了适应无血清全悬浮培养的F81细胞，并对此进行了冻存复苏、生长活力测定等工作，最终建立了可稳定传代的无血清全悬浮F81细胞系。以此细胞系为基础摸索猫泛白细胞减少症病毒繁育方法，采用同步接毒法，测试不同初始接毒细胞密度、不同MOI、不同时间收毒病毒滴度变化，以此确定繁育方法。

1.2.1 贴壁F81细胞复苏 从液氮罐中取1支40代的贴壁F81在38 ℃水浴锅中融化，在超净台内将冻存管中的液体转移到50 mL离心管中倒入MEM培养基补到15 mL，1 000 r/min，离心6 min，弃去上清液体，补加胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)浓度为100 mL/L的MEM(minimum essential medium)培养液至10 mL，倒入T25方瓶中，在体积分数为5%的CO2培养箱中37 ℃培养。待细胞长满单层后，用2.5 mg/mL胰蛋白酶消化传代，传代比例为1∶3。

1.2.2 贴壁F81细胞悬浮驯化 将复苏后的贴壁细胞连续培养6代～8代，待细胞形态正常、稳定生长后开始逐渐降低培养液中血清浓度，具体梯度为100、80、50、30、20、10、0 mL/L，每次降低血清浓度之前，需要确认在本血清浓度传代时细胞形态正常、生长规律稳定，细胞长满单层后进行下一梯度的降血清培养。待上一步得到的低血清贴壁F81细胞形态正常，稳定生长，经2.5 mg/mL胰酶消化后，加入同血清浓度的悬浮培养液15 mL终止消化，将方瓶内液体倒入50 mL离心管内，800 r/min，离心6 min，离心后加入少量悬浮培养液倒入125 mL摇瓶中，用吸管吹打，将细胞尽量吹散，取样计数，加入同等血清浓度悬浮培养液将细胞密度控制在1×106cells/mL，放到90 r/min的水平摇床上在体积分数为5%的CO2培养箱中37 ℃培养。每隔24 h监测一次，记录细胞密度、状态，传代周期为48 h。抽取F10、F20、F30代细胞绘制生长曲线及活率变化曲线。

1.2.3 建立无血清悬浮F81细胞细胞库 低血清悬浮培养F81细胞连续调整至稳定生长后，逐步或直接撤掉血清，得到无血清悬浮培养F81细胞。水平摇床转速调整为130 r/min，待无血清悬浮培养F81细胞，在镜下观察呈单个、透亮、细胞轮廓清晰，透亮度高，生长稳定后进行冻存、复苏、生长曲线绘制及生长动力学测定。

(1)细胞冻存：选择生长状态良好，生长活力稳定的无血清悬浮F81细胞25代，经800 r/min、 6 min离心处理后将细胞密度控制在1×107cells/mL，冻存液成分为700 mL/L无血清悬浮培养液、200 mL/L FBS、100 mL/L二甲基亚砜，按1 mL/管分装于冻存管内，装入程序降温冻存盒内，先经4 ℃暂时保存，后置-80 ℃冷冻过夜，次日转到液氮罐内长期保存，做好标记(细胞名称、培养液名称、血清浓度、代次、日期)。

(2)细胞复苏：在液氮罐内取出3支25代无血清悬浮F81放置于37 ℃水浴锅内快速融化，在生物安全柜内将细胞悬液转移到50 mL离心管中，补加无血清悬浮培养液至25 mL，1 000 r/min，离心6 min，倒去上清，振荡离心管，混匀沉淀物，补加无血清悬浮培养液15 mL，取样计数通过补液方式将细胞密度控制在1×106cells/mL，培养体积为30 mL，转移到125 mL摇瓶内，放到130 r/min水平摇床上，在体积分数为5%的CO2培养箱中37 ℃培养。

(3)无血清悬浮F81细胞生长曲线及生长动力学的测定：对冻存前后的生长数据进行分析处理，采用抽样方式，抽取F10、F20代及复苏后的F25代无血清悬浮培养F81细胞，初始传代密度为1×106cells/mL，置体积分数为5%的水培培养箱中37 ℃、130 r/min水平摇床上培养，每隔24 h取样计数，绘制生长曲线及测定最大生长密度、细胞活力和倍增时间。

倍增时间计算公式：

t=T/A

(1)

A=log2(Y/X)

(2)

式中:T为培养时间，h；X为初始接种细胞数，mL-1;Y为细胞最大增值密度前1 d的细胞数，mL-1;t为倍增时间，h；A为最大增值密度，mL-1。

(4)无菌及支原体检测:根据《中国兽药典》三部(2020版)相关规定进行检测。

1.2.4 猫泛白细胞减少症病毒培养条件摸索 复苏后稳定生长的无血清悬浮F81用于接毒试验，均采用同步接毒法，接毒细胞密度设置8×105cells/mL、10×105cells/mL、15×105cells/mL共3个组；MOI设置7×10-3、3.5×10-2、7×10-2共3个组进行接毒试验，置体积分数为5%的CO2培养箱的水培培养箱中37 ℃、130 r/min水平摇床上培养，48 h后间隔12 h留样检测病毒滴度。

2 结果

2.1 贴壁F81细胞形态

复苏后F81细胞形态(图1A)细胞呈长梭形，细胞形态正常，轮廓清晰，血清浓度降低后，在血清浓度调整到80、50、30、20 mL/L时，细胞形态会在2代～3代后随之变化，细胞会有少量脱落，有聚团趋势，经过3代～5代的调整后，细胞均能适应生长，恢复原来的形态，生长速度稍有放缓。在血清浓度为10 mL/L时，细胞贴壁能力明显变弱，调整多代后仍无效果，遂放弃；血清浓度为0 mL/L时，细胞基本不贴壁，停止生长。所以确定用MEM培养基最低血清浓度为20 mL/L(图1B和图1C)，生长速度与100 mL/L血清浓度时差别不明显，可以进行下一步悬浮驯化。

2.2 低血清悬浮F81细胞形态

细胞起悬后在F1～F8代时，细胞黏团较多，细胞碎片较多，经过吹散离心去团多次传代驯化后，细胞黏团减少，但依然存在，不能完全消除(图2)。起悬后细胞生长速度不稳定，由于细胞聚团较多，计数结果不能准确反映细胞生长情况，不能用来进行细胞生长稳定性分析。

A.血清浓度为100 mL/L时生长48 h后细胞形态；B.血清浓度初降为20 mL/L时生长48 h后细胞形态；C.驯化后适应血清浓度为20 mL/L时生长48 h后细胞形态

细胞传代至10代以后，细胞稳定规律生长，细胞还有聚团现象但多为3个～6个细胞的细胞团，黏团减少，多呈单个生长，每次传代初始细胞浓度为1×106cells/mL，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中130 r/min水平摇床上培养，每隔24 h取样计数，F10、F20、F30代低血清悬浮F81细胞生长曲线符合“S”形生长规律和细胞活力(图3)，其中F10、F20、F30代均在传代后72 h达到最大生长密度，分别为4.8×106、5.07×106、5.35×106cells/mL，倍增时间为30.95、29.32、30.09 h，到72 h活率均≥93%。

2.3 无血清悬浮F81细胞形态

两种降血清方法，骤降法效果更好，可直接消除血清对细胞聚团的影响。由20 mL/L降到10 mL/L再到0 mL/L组与20 mL/L组差别不大，依然有少量聚团。20 mL/L直接降到0 mL/L组与20 mL/L组差别较大，细胞团明显减少、细胞生长速度加快。经过无血清驯化后，细胞多呈单个生长，细胞透亮度高，活力好(图4)。

2.3.1 无血清悬浮F81细胞复苏成活率 细胞悬液37 ℃水浴融化后，经高速离心，去除冻存液，直接换成无血清培养液培养，死细胞占5%～10%，细胞恢复正常生长速度需要经过3代的调整后，可以达到冻存前的水平，没有出现细胞黏团，证明本次冻存液细胞可以用于无血清悬浮F81细胞的冻存，此冻存方法对细胞没有产生明显影响。

A.低血清悬浮培养初期(F1-F5)48 h后细胞形态，细胞生长速度慢，形态不规则，有大细胞黏团；B.低血清悬浮培养初期(F6-F8)48 h后细胞形态，细胞形态趋于圆形，生长速度快，仍有细胞黏团存在；C.低血清悬浮培养初期(F9-)48 h后细胞形态，细胞单个透亮，生长稳定，有少量细胞团

2.3.2 无血清悬浮F81细胞生长曲线及传代稳定性 无血清培养的F10、F20代及复苏后的F25代在初始传代密度为1×106cells/mL，置37 ℃、体积分数为5%的CO2的水培培养箱中130 r/min水平摇床上培养，每隔24 h取样计数，F10、F20及复苏后F25代无血清悬浮F81细胞生长曲线符合“S”形生长规律和细胞活力(图3)，其中F10、F20及复苏后F25代均在传代后96 h达到最大生长密度，分别为7.55×106、7.98×106、8.25×106cells/mL，倍增时间为25.27、26.18、26.36 h，到96 h活率均≥88%。

图3 低血清悬浮F81细胞生长曲线及活率

细胞单个圆形透亮，大小均一，生长稳定

通过对冻存前后驯化培养数据的总结分析，绘制了冻存前后的生长曲线(图5)。

2.4 猫泛白细胞减少症病毒增殖方法优化

检测不同细胞接毒密度、不同MOI、不同时间点样品，结果显示(表1)当细胞接毒密度为10×105cells/mL、MOI为3.5×10-2病毒滴度为最大值，病毒滴度为107.25TCID50/0.1 mL，因此确定该培养条件为FPV-BJ05悬浮细胞培养最适条件。

3 讨论

本研究为猫泛白细胞减少症病毒相关生物制品的研发提供了新思路，打破了传统培养方式，成功驯化了无血清全悬浮培养F81，生长迅速且稳定，可快速实现规模化培养，同时避免了动物源性成分对产品的不利因素，可为研究以F81为细胞基质的生物制品提供参考。

图5 冻存前后细胞生长曲线及活率

表1 不同细胞密度和MOI接毒检测结果

F81为猫肾细胞，贴壁性较强，相比于其他细胞驯化难度较大，但本团队经过低血清贴壁驯化、低血清悬浮驯化、无血清悬浮驯化三个阶段后，成功使其适应无血清悬浮培养，且生长稳定，细胞冻存复苏后，经过3代调整后，可恢复至冻存前的生长状态。F81细胞系可用于增殖犬瘟热病毒[8]、猫泛白细胞减少症病毒[9]、猫疱疹病毒[10]、猫杯状病毒[11]、水貂病毒性肠炎病毒[12]等，现常用的生产用细胞系多为贴壁形式的转瓶培养，或微载体形式培养，由于培养过程中需要添加胰酶、血清等，使得原料成本、人工成本居高不下，同时还会大大增加外源污染的风险，而本次建立的无血清全悬浮培养F81细胞系，对相关病毒的敏感性是否发生变化还有待于进一步进行。不需要添加血清，在生物反应器中可实现高密度大规模培养用于生物制品生产，且人为可精确控制，使得批次间产品几乎没有差异[13]，高密度细胞或将为生物制品制备带来新思路。

猫泛白细胞减少症病毒敏感性试验表明，相较贴壁细胞，无血清悬浮细胞更有优势，摆脱了血清的限制，接毒工艺方便可控，病毒滴度显著提高，产物更符合生产要求。对于悬浮细胞系与原贴壁细胞系在生物制品生产中是否存在区别，国外已有对于MDCK细胞用于生产流感疫苗相关报道，实验证明悬浮与贴壁在病毒培养过程中几乎没有差异[14],本细胞系相关试验还有待开展。

根据2020年宠物行业白皮书报告，我国仅城镇中猫饲养量就已经达到4862万只，比2019年增长10.2%，在宠物中占46%，而这一数据还不包含流浪猫和农村地区饲养的猫的数量，依此可以看出市场前景广阔。根据国家基础兽药库显示，迄今为止我国还没有商品化的用于猫科疾病预防的生物制品，现还完全依赖进口，受新冠疫情影响，疫苗进口数量锐减，部分地区出现断货情况，本试验得到的无血清悬浮培养F81可尝试用于多种病毒培养、抗原制备等工作，有助于填补国内相关生物制品空白，帮助我们早日摆脱现状。下一步将继续测试该细胞系对不同毒株的病毒敏感性和摸索生物反应器培养条件等工作。