过表达米曲霉AoNarmp1 基因对米曲霉生长和曲酸合成的影响

邓帮福，范俊侠，姚丽华，张 哲

（江西科技师范大学生命科学学院，江西 南昌 330013）

1 前言

生物体在进行生命活动时需要金属离子作为蛋白质的辅助因子[1]。Nramp 蛋白是一种具有典型多肽分子的膜转运蛋白，其跨膜结构域是Nramp 蛋白参与生物体跨膜运输与金属离子的转运和利用的关键[2，3]。Nramp 转运蛋白可以特异选择一种或多种金属来进行转运。目前发现其可以转运Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Co2+、As2+和Ni2+等离子。Nramp 蛋白在动物中被广泛研究，主要探究了Nramp 蛋白抗侵染病原微生物作用机制[4]。Nramp 蛋白也广泛存在于植物中，它对植物转运金属离子和维持离子平衡起着重要作用[5]。Nrmap 蛋白在微生物中也具有金属转运活性[6]，酿酒酵母中有3 个编码Nramp 家族蛋白的基因：SMF1、SMF2 和SMF3，它们在酿酒酵母中都参与金属离子的转运[7]。

曲酸是一种主要由米曲霉合成的具有多种生物活性的有机酸，被广泛用于食品、医药、农业、美容等行业[8，9]。米曲霉曲酸的合成调控与转运蛋白密切相关。转运蛋白KojT 参与转运曲酸到胞外[10]。进一步研究发现转运蛋白AoKap4 与KojT 协同参与曲酸的转运[11]。此外，其他转运蛋白，如AoKap1、AoKap2 和NrtA 也被发现参与曲酸合成[12，13，14]。米曲霉中Nramp 转运蛋白基因AoNramp1 已被克隆[4]，但AoNramp1 作为转运蛋白是否也会影响曲酸合成，目前尚无报道。

本研究首先利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 启动子构建了AoNramp1 过表达菌株，然后对比分析了其与野生型3.042 菌株在不同离子处理下的菌丝生长情况和孢子数目形态。同时，分析了其对米曲霉曲酸合成的影响，以期为全面理解米曲霉Nramp家族基因的功能提供参考。

2 实验部分

2.1 菌株与培养基

米曲霉3.042 菌株（CICC 40092）作为野生型菌株。Czapek-Dox（CD）培养基（2%可溶性淀粉、0.2%NaNO3、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4、0.05% KCl、0.05%NaCl、0.002% FeSO4，pH 5.5）作为表型观察和曲酸发酵的培养基。

2.2 过表达载体的构建

以米曲霉3.042 基因组DNA 为模板，使用引物pEX2B-AoNramp1-F/R，通过PCR 扩增获得AoNarmp1片段。重组质粒pEX2B-AoNramp1 是将该片段通过同源重组连接到线性化的pEX2B 载体[15]。该载体携带有米曲霉α 淀粉酶基因amyB 启动子和trpC 终止子。PEG 原生质体法可将测序后的质粒转化到米曲霉3.042 的ΔpyrG 菌株中。PCR 法可验证AoNramp1过表达菌。

2.3 聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化法

米曲霉转化采用改进的PEG 介导的原生质体转化法[16]。首先用DPY 培养基（2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.5% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O，pH 5.5）培养米曲霉，30°C 培养20 h 后收集菌丝，用含有50 mM 马来酸（pH 5.5）和0.6 M（NH4）2SO4的溶液洗涤2 次，沥干；然后用过滤除菌的酶解溶液（50 mM 马来酸、1%Yatalase、0.5%Lysing enzymes、0.6 M（NH4）2SO4，pH 5.5）与菌丝混合，60～70 rpm 搅拌，30°C 避光裂解3 h 后，加入等体积的转化溶液（1.2 M sorbitol、50 mM CaCl2·2H2O、35 mM NaCl、10 mM pH=7.5 的Tris-HCl 溶液）摇晃几次，将上述酶液通过灭菌的双层擦镜纸过滤，用圆底管收集过滤液，4° C 离心收集原生质体。用转化溶液洗涤原生质体一次，再离心收集，放在冰上，备用。将备好的质粒（10 μg）与该原生质体（200 μL）混匀。冰浴30 min，然后分3 次分别加入250 μL、250 μL、850 μL PEG溶 液（60%PEG 4000、50 mM CaCl2·2H2O、10 mM pH=7.5 的Tris-HCl 溶液）混匀后避光放置20 min。随后用适量转化溶液终止反应；离心收集原生质体，倒入适量的Top MM 培养基（0.2%NH4Cl、0.1%（NH4）2SO4、0.05% KCl、0.05% NaCl、0.1% KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.002% FeSO4·7H2O、2% glucose、0.15% methionine、l.2 M sorbitol、0.8% agar，pH 5.5）混匀，最后将上述Top MM 培养基平铺在MM 培养基上，培养3～5 天。

2.4 表型分析

菌株孢子液接种到CD 培养基上，在30 °C 培养3 天后进行表型分析。在CD 培养基中分别加入200 μM ZnSO4、200 μM FeSO4、200 μM MnSO4、200 μM CuSO4用作不同金属离子处理米曲霉。十字交叉法用于测定菌丝生长直径。洗孢液（0.025%Tween 80、0.8%NaCl）被用于收集菌落孢子，并通过血球计数板计算孢子数目。每个实验都进行了三个生物学重复。

2.5 RNA 的提取

收集的菌丝样品经液氮处理后研磨成粉末。按照真菌总RNA 提取试剂盒（Omega，R6840）说明书提取总RNA。

2.6 表达量分析

提取的RNA 用gDNA Eraser（TaKaRa）去除基因组DNA，然后按照反转录试剂盒（TaKaRa）进行反转录获得cDNA。利用CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）进行qPCR，使用的定量试剂盒是SYBR Green PCR Kit（TaKaRa）。米曲霉Histone H1基因（AO090012000496）作为内参基因。所有实验均重复三次。

2.7 曲酸含量的测定

将100 μL 米曲霉菌株的分生孢子悬浮液（108个/mL）接种到含有40 mL 改良CD 液体培养基的锥形瓶中；在30°C 下培养7 天后，收集上清液，用FeCl3显色法[4]测定曲酸的浓度（mg/mL）；取0.5 mL 发酵液，与1 mL FeCl3-HCl 溶液（0.06 M FeCl3、0.27 M HCl）混合，然后加0.5 mL 双蒸水混匀后，使用酶标仪（Thermo Scientific）在500 nm 处测定混合液的吸光度；用双蒸水代替曲酸发酵液作为对照组；依据上述显色反应体系绘制曲酸的标准曲线（0～0.4 mg/ml）；利用测定的混合液吸光度和曲酸标准曲线即可计算出曲酸的浓度。同时，收集培养7 天后菌丝体，并在65 °C 下干燥至恒重，曲酸的含量（mg/mL·g）等于曲酸的浓度除以生物量。

3 结果与讨论

3.1 过表达AoNramp1 对米曲霉生长的影响

为了研究AoNramp1 在米曲霉生长中的作用，本文利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 启动子构建了2 株AoNramp1 过表达菌株：OE-1 和OE-8（图1AC）。基因表达分析显示，相对于野生型，OE-1 和OE-8 中AoNramp1 的表达提高了28 倍（图1B）。为了探究在金属离子处理下过表达AoNramp1 对米曲霉生长的影响，本文选用200 μM ZnSO4、200 μM FeSO4、200 μM MnSO4、200 μM CuSO4分别处理了野生型WT、OE-1 和OE-8 菌株。相比之下，过表达AoNramp1菌株比野生型菌株的的菌丝生长直径明显变小（图1C，D）；而且过表达AoNramp1 菌株的湿重比野生型菌株的小（图1E）。Zn2+处理增加野生菌株的湿重，而Zn2+对过表达AoNramp1 菌株的湿重无明显促进作用，表明AoNramp1 基因与Zn2+相关。而Cu2+对野生型菌株和过表达AoNramp1 菌株的湿重都有明显抑制作用。这些结果表明，过表达AoNramp1 抑制了米曲霉菌丝生长，而Zn2+促进了米曲霉菌丝生长，且AoNramp1 与Zn2+有关。

图1 过表达AoNramp1 对米曲霉生长的影响：（A）利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 启动子过表达AoNramp1 基因的示意图；野生型（WT）与AoNramp1 过表达菌株（OE-1 和OE-8）中的AoNramp1基因表达水平（B），在不同金属处理下的菌丝生长情况（C）和生长直径（D）及菌丝湿重（E）

3.2 过表达AoNramp1 对米曲霉孢子生长的影响

在与上文同样的实验条件下，本文研究发现过表达AoNramp1 菌株的孢子数显著少于野生型菌株（图2A，B），但不同金属离子对孢子形成的影响是不一样的。Cu2+会抑制米曲霉孢子的形成，而Zn2+、Fe2+、Mn2+则能促进米曲霉孢子的形成，其中Mn2+显著促进野生型菌株产孢子，而Fe2+显著促进过表达AoNramp1 菌株产孢子（图2A，B），这说明过表达AoNramp1 影响Fe2+、Mn2+对米曲霉孢子形成。孢子大小测试结果显示过表达AoNramp1 菌株显著大于野生型菌株的孢子直径（图2C）。

图2 过表达AoNramp1 对米曲霉孢子形成的影响：不同金属处理后的野生型菌株（WT）与AoNramp1 过表达菌株（OE-1 和OE-8）的孢子显微形貌（A）、孢子数量（B）、孢子直径（C）

3.3 过表达AoNramp1 对米曲霉菌球生长的影响

在与上文同样的实验条件下，本文研究发现过表达AoNramp1 菌株的菌球直径显著大于野生型菌株（图3 A，B），其中Fe2+、Cu2+对过表达AoNramp1菌株的菌球直径增大效果较为显著。菌球的干重分析结果显示过表达AoNramp1 与野生型菌株无显著性差异（图3C）。这些结果表明，过表达AoNramp1增加了米曲霉在液体培养基中的菌球直径，且Fe2+、Cu2+的促进效果最为明显，但没有影响米曲霉的生物量。

3.4 过表达AoNramp1 对米曲霉曲酸合成的影响

为了研究AoNramp1 对米曲霉曲酸合成的影响，本文将WT、OE-1 和OE-8 的孢子液接种在液体CD 曲酸发酵培养基中，30 °C 培养7 天。曲酸能够与Fe3+发生显色反应生成红色复合物，从而定性分析菌株的曲酸合成情况。研究结果显示AoNramp1过表达菌株比野生型菌株的显色明显较浅（图4A），这表明过表达AoNramp1 抑制了曲酸的合成。AoNramp1 过表达菌株比野生型菌株的曲酸合成量显著减少（图4B）。曲酸合成相关基因kojA、kojR、kojT的表达分析表明，相对于野生型，过表达AoNramp1菌株中的基因表达量都显著下调（图4C-E）。这些结果表明，AoNramp1 可能是通过抑制曲酸合成相关基因的表达来抑制米曲霉曲酸的合成。这种抑制作用可能来自Zn2+的影响[17-19]。

图4 过表达AoNramp1 对米曲霉曲酸合成的影响：野生型菌株（WT）与AoNramp1过表达菌株（OE-1 和OE-8）所产的曲酸显色反应（A），曲酸含量（B）；野生型与AoNramp1过表达菌株中曲酸合成相关基因kojA（C）、kojR（D）和kojT（E）的表达水平

4 结论

总之，本文研究表明过表达AoNramp1 会抑制米曲霉菌丝的生长，而Zn2+会促进米曲霉菌丝的生长，且AoNramp1 与Zn2+有关；过表达AoNramp1 使得米曲霉孢子数减少、孢子直径增大，且Cu2+作用最为明显；过表达AoNramp1 增加了米曲霉在液体培养基中的菌球直径，且Fe2+、Cu2+的促进效果最为明显，但不影响米曲霉的生物量；AoNramp1 可能是通过抑制曲酸合成相关基因kojA、kojR、kojT 的表达来抑制米曲霉曲酸的合成。本研究为理解Nramp 蛋白在米曲霉生长和曲酸合成中的作用提供了一定的参考。