猪源肺炎克雷伯菌荧光定量PCR 检测方法的建立与应用

郭学波，邱振乾，张超，战爽，吴瑶

1.汉唐和元（武汉）科技有限公司，湖北武汉 430070；

2.宜城市动物疫病预防控制中心，湖北宜城 441400）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）属于革兰氏阴性菌，为肠杆菌科成员，对多种动物致病，是重要的医源性感染菌之一[1]。研究表明，医源性Kp 与动物源性Kp 亲缘关系较近，携带的毒力因子大致相同[2-4]，但后者具有较强的耐药性和致病性[5]。Kp 的荚膜与致病力有关。当宿主免疫力降低时，Kp 能引起人呼吸道、泌尿道感染，有时可导致严重的腹膜炎、脑膜炎，甚至败血症[6-7]，尤其易引起儿童肺炎；此外，也可引起牛乳腺炎[8]、母马子宫炎[9]、新生仔猪败血症等疾病，导致极高的致病率和死亡率[10-11]。

目前，Kp 常用的检测方法有细菌分离鉴定、生化试验、动物致病性试验等，但这些方法均存在灵敏度较低、检测耗时较长及费用较高等问题，因此建立一种快速准确灵敏的检测方法已成为迫切需要。研究[12]表明，Khe基因具有溶血素活性，是Kp 高度保守且特异的基因序列，目前仅发现于Kp中。以Khe基因为靶标进行流行病学检测，已应用于牛源Kp。本研究以Khe基因为靶标，建立了猪源Kp 的荧光定量PCR 快速检测方法，以期为猪群肺炎克雷伯菌病的临床诊断及防控提供有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株与临床样品 大肠杆菌标准株（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌标准株（ATCC29213）、化脓性链球菌标准株（ATCC19615），由杭州天和微生物试剂有限公司提供；猪源Kp、猪2 型链球菌、副猪嗜血杆菌、猪坏死杆菌、猪细胞内劳森菌、猪丹毒杆菌，由华中农业大学预防兽医学实验室提供；25 份肺炎症状病料，由湖北省各发病猪场送检；115 份鼻咽拭子样品，采自湖北省武汉市、宜城市、黄石市屠宰场。

1.1.2 主要仪器与设备 美国伯乐CFX96 PCR仪，西安天隆TL988 全自动PCR 分析系统，日本松下SANYO MIR-554-PC 恒温培养箱，德国Eppendorf Centrifuge 5425R 高速冷冻离心机，英国Biochrom 超微量核酸/蛋白分析仪，武汉新纵科DS1000 Tissue Cell-destroyer 高效组织细胞样品处理系统，上海申安LDZM-60KCS 全自动高压蒸汽灭菌锅。

1.1.3 主要试剂与耗材 麦康凯（MAC）培养基、肉汤培养基，购自Oxoid 公司；Taq酶、UNG 酶、酶稀释液、胶回收试剂盒、细菌基因组DNA 提取试剂盒，购自武汉晟亚生物科技有限公司；肠杆菌科生化鉴定试剂盒，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4 引物及探针设计 参考多株GenBank 上公布的猪源KpKhe基因序列，分析选定高度保守区域。利用Primer Express 3.0 和Beacon Designer 8软件分别设计引物和探针，送至武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成（表1）。

表1 引物和探针序列

1.2 方法

1.2.1 阳性标准品制备 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取Kp DNA。通过PCR 扩增Khe基因，经电泳鉴定目的片段大小正确后，回收并纯化目的片段，连接至pUC18-T 载体，转化感受态细胞；测序结果与预期相符的作为阳性菌种，提取质粒作为阳性质粒，命名为pUC-Khe；采用超微量核酸分析仪测定阳性质粒的浓度和纯度，换算为拷贝数；对阳性质粒进行10倍梯度稀释，作为阳性标准品。

1.2.2 反应体系与扩增条件 以阳性质粒pUC-Khe为模板，在荧光定量PCR 仪上依照反应体系进行反应。反应体系：2 × qPCR Mix 12.5 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，KheF00A（5 μmol/L）和KheR00A（5 μmol/L）各1.0 μL，KheP00A（2.5 μmol/L）1.0 μL，模板2.0 μL，双蒸水补至总反应体系25.0 μL。PCR 反应条件：UNG 酶50 ℃活化2 min；Taq酶95 ℃活化5 min；95 ℃15 s，58 ℃ 30 s（收集荧光），共40 个循环。

1.2.3 标准曲线建立及灵敏性试验 根据阳性质粒实际浓度测定值，将pUC-Khe稀释至拷贝数浓度为1.0×l07～1.0×103copies/μL 进行扩增反应，绘制标准曲线；建立标准曲线后，将pUC-Khe稀释至拷贝数浓度为1.0×108～l.0×101copies/μL 进行荧光定量PCR 反应，确定该方法的最低检测限。

1.2.4 特异性试验 提取大肠杆菌标准株（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌标准株（ATCC29213）、化脓性链球菌标准株（ATCC19615）及猪2 型链球菌、副猪嗜血杆菌、猪坏死杆菌、猪细胞内劳森菌、猪丹毒杆菌核酸，采用建立的荧光定量PCR 方法进行扩增，同时使用pUC-Khe质粒为阳性对照，无菌无酶水为阴性对照，评价该方法的特异性。

1.2.5 重复性试验 分别取同批次提取的4 份等量Kp DNA，按上述反应体系与扩增条件进行荧光定量PCR 检测，每份样品重复5 次，进行批内重复性试验；分别取3 个不同批次提取的4 份等量Kp DNA，在完全相同的反应条件与体系下进行荧光定量PCR 检测，进行批间重复性试验。每次试验均彼此独立，互不影响。

1.2.6 临床样品检测 采用本研究建立的荧光PCR 方法和细菌分离鉴定方法，对25 份猪肺脏样品病料及115 份猪鼻咽拭子样品进行同步检测，比较2 种方法的检测结果。

2 结果

2.1 阳性标准品制备

选择1.5%琼脂糖凝胶进行PCR 产物电泳。结果（图1）显示，目的片段大小为257 bp，与预期大小相符。构建的质粒经测序验证，与预期目的基因序列相符，表明成功构建阳性质粒。

图1 阳性质粒构建结果

2.2 标准曲线建立及灵敏性试验

采用建立的方法检测系列稀释的阳性质粒，以水作为阴性对照。根据Ct 结果，建立标准曲线。结果显示，当阳性质粒的拷贝数浓度为1.0×l07～1.0×103copies/μL 时，模板浓度与检测Ct值之间具有良好的线性关系（R2=0.995 9）（图2）；当阳性质粒浓度为101copies/μL 时，仍可见明显扩增曲线（图3）。

图2 标准曲线

图3 灵敏性试验结果

2.3 特异性试验

采用建立的方法检测相关菌株的阳性核酸，以pUC-Khe为阳性对照，水为阴性对照（所有样品均进行3 次重复试验）。结果（图4）显示，对照菌株及阴性对照在反应中均无荧光信号出现，而阳性质粒pUC-Khe具有较好的扩增动力学曲线，表明本方法特异性较强。

图4 特异性试验结果

2.4 重复性试验

结果（表2）显示，批内变异系数 为0.54%～1.13%，批间变异系数为0.37%～1.27%，均不超过2%，表明该检测方法具有较好的重复性。

表2 重复性试验结果

2.5 临床样品检测

结果（表3）显示，在140 份待检病料中，建立的荧光定量PCR 方法检测出阳性31 份，阳性率为22.14%；细菌分离鉴定方法检测出阳性27 份，阳性率为19.29%。相比可知，荧光定量PCR 方法的阳性检出率高于细菌分离鉴定方法。

表3 两种方法检测临床样品结果比较

3 讨论

针对Kp 的流行病学研究，目前多集中在人医领域。对其耐药性与致病性进行讨论，其主要目的是为临床用药提供指导[13-15]。动物源性Kp 的流行病学研究相对较少，并且主要为牛源。猪源Kp 的研究大多集中于分离鉴定，有部分研究进行了分子生物学特性分析及流行病学调查。左伟等[16]对西藏林芝地区的60 份藏猪腹泻粪便样本进行Kp分离与生物学特性研究，结果分离出3 株藏猪源Kp，分离率为5%；李雪嵩[17]对吉林省部分规模化养猪场疑似受Kp 感染的病料进行致病性及致病基因分子生物学检测，结果所有分离株都携带Khe基因；董萌萌等[18]对河南省疑似Kp 感染病例进行确诊，其基因同源性与Kp 参考株均在98%以上。

目前动物源性Kp 常用的检测方法有细菌分离培养、革兰氏染色、生化试验以及动物致病性试验等，但这些检测方法都需对细菌进行培养。一方面对检测场所的设施、环境、仪器以及人员有了更高的要求，另一方面增加了生物安全防护风险。近年来也有一些新的检测方法，如付霞丽等[19]的16S rRNA 基因PCR 扩增，梁慧贤等[20]的全基因组测序等，但这些方法大都限于实验室研究，未能推广到养殖行业的现实应用中。本研究建立的荧光定量PCR 检测方法，相比微生物学方法减少了二次污染的风险，并且检出率更高；相比其他分子生物学方法，灵敏度更高，结果可直接观察。本方法特异性强，能有效检出Kp 分离株，并且和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、猪2 型链球菌、副猪嗜血杆菌、猪坏死杆菌、猪细胞内劳森菌和猪丹毒杆菌等其他病原无交叉反应；灵敏度高，最低检测限为10 copies/μL；重复性好，批内及批间变异系数均小于2%。经过临床样本检测验证，本方法的阳性检出率高于细菌分离鉴定方法，说明本方法具有较好的应用价值，能够用于猪群肺炎克雷伯菌病的诊断和防治。