商用BT 细胞中污染病毒的检测及基因序列分析

桂亚萍，白艺兰，刘健，王建，赵洪进

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

作为重要的细胞基质，动物源性细胞系已在科学研究和生物制品生产方面获得了广泛应用。但由于其所用细胞、血清等均为动物源性材料，极易受到外源因子尤其是病毒的污染，导致潜在的生物安全风险[1]。张志等[2]从14 个省份的猪瘟细胞疫苗和猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗中检出9份牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）阳性样品。有研究[3]对墨西哥6 批次单价疫苗、8 批次疫苗生产所用细胞系和10 批次胎牛血清进行检测后发现，62.5%的样本存在BVDV RNA 污染。

牛鼻甲骨（BT）细胞是用于多种牛病毒培养和检测的重要牛源细胞系，对其外源病毒进行检测尤为重要。已有研究[4]表明，BVDV可污染BT细胞、牛肾细胞等多种牛源细胞，同时牛细小病毒（bovine parvovirus，BPV）、呼肠孤病毒3 型（mammalian orthoreovirus 3，Reo3）、牛腺病毒3 型（bovine adenovirus type 3，BAdV-3）、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratorysyneytial virus，BRSV）和牛副流感病毒3 型（bovine parainfluenzavirus type 3，BPIV-3）也是造成牛源细胞系污染的重要病原。因此，对BT 细胞进行以上病原的检测，对于后续试验结果的准确性和防止潜在的病毒传播具有重要意义。本研究通过PCR 扩增，细胞病变观察，以及阳性病原部分基因序列测序和分析，对商用BT 细胞进行相应病毒检测，以期为商用BT 细胞的质量控制提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 BT 细胞，购自某生物公司。

1.1.2 主要试剂 0.25%的胰酶消化液（批号AU202111）、胎牛血清（批号AU204825），购自BIOODIN 公司；DMEM 细胞培养液（批号2467189）、PBS（批号8121484），购自GIBCO 公司；核酸提取试剂盒（批号MDJL09-1），购自Magen公司；Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）反转录试剂盒（批号AL52736A）、PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye，批号AI12330A），购自宝生物工程（大连）公司。

1.2 方法

1.2.1 BT 细胞相应病毒检测 对BT 细胞收毒后反复冻融3 次，2 000 r/min 离心5 min，取上清液备用。参考文献[5-7]设计BVDV、BPV、Reo3、BAdV-3、BRSV 及BPIV-3 检测引物（表1），由上海桑尼生物公司合成。按照核酸提取试剂盒说明书要求提取BT 细胞上清液总核酸，并以此为模板，根据Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）反转录试剂盒说明书要求，分别进行BVDV、Reo3、BRSV 和BPIV-3 的RT-PCR 扩增。扩增体系：2×Buffer 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，模板2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。一步法RT-PCR 扩增程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。按核酸提取试剂盒说明书要求，提取离心后的BT 细胞上清液DNA，以此为模板，根据PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye）说明书要求，分别进行BPV和BAdV-3 的PCR扩增。扩增体系：2×Buffer 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，PremixTaq1.0 μL，模板 2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。PCR 扩增程序：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，阳性PCR 产物送上海桑尼生物公司测序，测序结果提交NCBI 进行BLAST 比对分析。

表1 6 种病毒的检测引物

1.2.2 细胞培养原材料BVDV 检测 各吸取200 μL DMEM 细胞培养液、PBS、胰酶、胎牛血清，按照核酸提取试剂盒说明书要求分别提取总核酸，以BT 细胞提取总RNA 为阳性对照组，扩增体系和程序同1.2.1，进行BVDV RT-PCR 扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 BT 细胞中BVDV 增殖检测 经BT 细胞传代培养7 d，每隔1 d 观察细胞病变情况并吸取200 μL 细胞培养上清液备用；提取不同时间段的BT 细胞上清液总核酸，以BVDV-F/R 为引物进行RT-PCR 扩增，扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 BVDVNpro和E2基因扩增 参考文献[8-9]设计并合成靶向BVDVNpro和E2基因的特异性引物（表2），以BT 细胞冻融离心后上清液所提总RNA 为模板，采用两对特异性引物分别扩增Npro和E2基因片段，阳性PCR 产物送上海桑尼生物公司测序。

表2 BVDV 特异性扩增引物

1.2.5 序列比对分析 对获得的5'UTR、Npro以及E2基因序列进一步处理后，与GenBank 上发表的BVDV 参考序列（表3）进行比对分析，利用MEGA 6.0 软件，采用邻接法构建系统进化树。

表3 BVDV 参考毒株信息

2 结果

2.1 BT 细胞中病毒的PCR 检测

以提取的BT 细胞总RNA 为模板分别进行BVDV、BPV、Reo3、BAdV-3、BRSV 及BPIV-3等6 种病毒的PCR 扩增。经琼脂糖凝胶电泳检测，仅BVDV 出现目的条带，其他病毒未出现相应条带（图1），进一步对阳性产物测序结果进行BLAST 分析，确定为BVDV 基因序列。

图1 BT 细胞BVDV PCR 扩增结果

2.2 原材料BVDV 检测

分别对培养细胞所用原材料DMEM 细胞培养液、PBS、胎牛血清、胰酶进行BVDV 检测，结果均为阴性（图2）。

图2 原材料PCR 扩增结果

2.3 细胞病变观察

对BT 细胞传代培养后，分别在相应时间段观察细胞状态。结果（图3）显示，7 d 内随着培养时间的增加，BT 细胞一直未出现明显病变。

图3 不同时间段BT 细胞生长情况

2.4 细胞培养上清液检测

对提取的不同时间段的BT 细胞培养上清液总核酸进行RT-PCR 扩增，后经琼脂糖凝胶电泳检测。结果（图4）显示，样品在302 bp 处有一条带，与预期结果一致，且条带的亮度随着培养时间的增加而逐渐增强，表明BT 细胞中存在BVDV 病毒，且该病毒可以在细胞内增殖。

图4 不同时间段BT 细胞上清液RT-PCR 扩增结果

2.5 BVDV Npro和E2 基因扩增

分别利用BVDV的Npro以及E2基因特异性引物，对BT细胞总RNA进行RT-PCR扩增。结果（图5）显示，2 对特异性引物均能扩增出与预期大小相符的特异性条带，而阴性对照未出现相应条带。

图5 BVDV Npro和E2 基因RT-PCR 扩增结果

2.6 BVDV 5'UTR、Npro和E2 基因序列比对

BT 细胞中检出的病毒被命名为BVDV202201，对其扩增的部分基因序列进行同源性以及遗传进化分析。同源性分析结果显示：BVDV202201 的5'UTR 基因与USMARC-53875 株核苷酸同源性最高，为97.0%，与疫苗株Oregon C24V 株核苷酸同源性为96.4%，与BVDV-2型代表株 890 株的核苷酸同源性最低，仅为77.3%；Npro基因与Oregon C24V 株核苷酸同源性为90.7%，与BVDV-2 890 毒株的核苷酸同源性仅为70.7%；E2基因与Oregon C24V 株、USMARC-53875 株核苷酸同源性分别为89.7%和88.3%，与BVDV-2 890 毒株的核苷酸同源性仅为77.3%。基于5'UTR 和Npro 构建的遗传进化 树（图6～7）显示，BVDV202201 与Oregon C24V 株亲缘关系最近，同处于BVDV-1a 中的一个小分支；基于E2基因构建的遗传进化树（图8）显示，BVDV202201 与Oregon C24V株、USMARC-53875 株亲缘关系较近，同处于BVDV-1a 中的一个较大分支。以上结果表明，BVDV202201 属于BVDV-1a 型。

图6 BVDV 5'UTR 序列的进化树分析结果

图7 BVDV Npro 序列的进化树分析结果

图8 BVDV E2 序列的进化树分析结果

3 讨论

BT 细胞不仅被广泛用于牛病毒的实验室检测，也可作为疫苗生产用细胞基质，因此控制其外源病毒污染是保障生物安全的必要前提。本研究对可能污染BT 细胞的6 种病毒进行检测，发现细胞中含有BVDV 病毒，在排除各原材料影响后，确定该细胞系中存在BVDV 污染。张超等[10]在对进口胎牛血清和脱脂奶粉进行检测时均发现存在BVDV 的抗原和抗体污染；朱晓玮等[11]从牛血清、牛睾丸细胞等牛源材料中均可检出BVDV 病毒，甚至在后续产品加工过程中仍有部分阳性检出。以上研究表明，BVDV 在牛源材料中的污染情况可能广泛存在。

本研究对BT 细胞进一步传代培养观察，发现检出的BVDV 病毒可在BT 细胞中增殖但不产生细胞病变。BVDV 是引起牛消化、呼吸以及生殖系统疾病的重要病原体，不仅影响牛群生产性能造成严重经济损失，也是牛源材料中的主要污染物[12]。根据是否引起细胞病变，可将BVDV 分为致细胞病变和非致细胞病变两种生物型，其中非致细胞病变的BVDV 可在细胞系中持续感染，是实验室细胞污染的重要传染源[13]。

BVDV 病毒中的5'UTR、Npro以及E2基因多用于鉴定不同毒株的基因型[14]。根据5'UTR 等基因的差异，可将BVDV 分为BVDV-1、BVDV-2 和BVDV-3 3 种基因型，其中的BVDV-1 型作为主要流行株已报道了1a—1u 至少21 种基因亚型[15]。本研究从BT 细胞中发现BVDV 病毒，将其命名为BVDV202201，结合5'UTR、Npro和E2基因序列的遗传进化分析，发现该病毒与北美的Oregon C24V 株亲缘关系较近，属于BVDV-1a 型毒株。Oregon C24V 毒株属于可引起MDBK 细胞病变的毒株，已作为BVDV 疫苗株被广泛应用。由于BVDV202201 与Oregon C24V 毒株位于同一分支，极有可能具有相似的生物学特性，提示其具有作为疫苗株研究的潜质。

本研究通过PCR扩增、传代培养、测序等方法，在商用BT 细胞中检出不引起细胞病变的BVDV病毒，经遗传进化分析发现，其与BVDV-1a 经典毒株Oregon C24V 亲缘关系较近，这为商业化BT细胞用于生产和科研工作的质量控制提出了重要污染警示。