SLAMF6、BCL-2/Bax对重型再生障碍性贫血患者HSCT疗效的预测价值分析*

刘晓燕，刘文超，尹婷婷

邯郸市第一医院：1.血液内科；2.老年病一科，河北邯郸 056000

重型再生障碍性贫血(SAA)是骨髓造血功能衰竭引起的一种血液系统重症，具有发病急、进展快及病死率高等特征[1]。目前,强化免疫抑制治疗及造血干细胞移植(HSCT)是临床治疗SAA的重要手段，但前者初次治疗失败率可达30%以上，且治疗有效的患者亦存在10%～20%的复发风险，而HSCT优势在于造血重建快，长期生存率可达70%以上，且多数无需维持治疗，治疗更彻底[2-3]。临床数据显示，影响SAA患者HSCT疗效的主要因素有移植物抗宿主病、感染、出血等并发症，而HSCT治疗后中性粒细胞及血小板植活情况与上述并发症发生或存在直接关系[4-5]。因此，早期预测HSCT疗效不仅有助于积极完善干预策略提升患者获益率，改善生存状况，且利于节约医疗资源，减轻社会及家庭负担。B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bax蛋白)是一对与细胞凋亡平衡有关蛋白，多项研究显示，BCL-2/Bax与骨髓造血功能有关[6-7]。信号淋巴细胞激活分子家族6(SLAMF6)主要在NK、T、B等免疫细胞中表达，其主要有负调控自身免疫功能的作用[8]。EISENBERG等[9]研究显示，SLAMF6可通过激活CD8+T淋巴细胞而参与肿瘤免疫的生物学过程。CD8+T淋巴细胞作为SAA的重要效应细胞，SLAMF6的异常表达是否与SAA患者HSCT疗效有关尚无定论。本研究通过探讨SAA患者HSCT治疗前后外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax变化，旨在为临床完善HSCT疗效评估机制提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2017年3月至2020年10月于本院接受HSCT治疗的SAA患者56例纳入研究。纳入标准：(1)符合SAA诊断标准[10]，至少满足以下项目中的2项，①网织红细胞<1%，绝对计数<15×109个/L，②中性粒细胞绝对计数<0.5×109个/L；③血小板<2×109个/L；(2)无其他血液疾病及免疫性疾病；(3)对本研究内容知情同意并签署知情同意书。排除标准：(1)入组前1周内有免疫调节剂、皮质类固醇激素用药史；(2)妊娠；(3)有严重肝肾心功能障碍；(4)有肺部等活动性感染。

1.2方法

1.2.1HSCT治疗 患者入院完善对应检查，明确是否有HSCT禁忌证及适应证。预处理：兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白[enzyme Europe B.V.，S20150035，规格：25毫克/瓶(每瓶含兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白25 mg,复溶后体积5 mL)，3.5 mg/(kg·d)，连续5 d]+氟达拉滨(江苏奥赛康药业有限公司，国药准字H20064228，规格：50 mg，30 mg/m2，连续5 d)+环磷酰胺[江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32020857，规格：0.2 g，60 mg/(kg·d)，连续2 d]。移植物抗宿主病防范：全相合移植者予以环孢素A+短程甲氨蝶呤。造血干细胞动员、采集、回输：供者皮下注射粒细胞集落刺激因子(G-CSF)300 μg/d，连续4 d，第5天采集骨髓回输，次日COBE血细胞单采机[埃克森(北京)科技有限公司]分离外周干细胞，回输。移植前2周，静滴更昔洛韦预防巨细胞病毒感染，予以肝保护药物预防肝静脉阻塞综合征，移植前1 d予以抗感染预防性治疗，移植后的白细胞低谷期服用立康唑片，移植后7～10 d静脉用丙种球蛋白。定期检测巨细胞病毒感染，予以静脉营养及对症支持治疗等。HSCT后1年内每隔3个月全面体检1次。HSCT疗效评价：中性粒细胞植活标准为首次连续3 d中性粒细胞绝对值>0.5×109/L；血小板植活标准为脱离血小板输入，且连续7 d血小板计数>20×109/L。

1.2.2指标检测 (1)外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量：采用肝素抗凝真空管采集肘静脉4 mL。实验管加特异性抗体鼠抗人CD3-APC、CD8-FITC、SLAMF6-PE分别5 μL，同时对照管加特异性抗体鼠抗人CD3-APC、CD8-FITC及同型对照抗体PE-IgG1分别5 μL，每管加所采集外周血标本100 μL，混匀，孵育15 min(4 ℃避光)，加溶血素1 mL，室温避光溶解红细胞(8 min)，离心，弃上清，PBS洗2次，上机测SLAMF6表达量。(2)BCL-2/Bax：非抗凝真空管采集肘静脉血4 mL，离心10 min(9 000×g)，取上清，孵育2 h(37 ℃)，加BCL-2、Bax抗体，孵育2 h(37 ℃)，加底物，孵育30 min(37 ℃)，测吸光度(A)值，标准曲线下获得BCL-2、Bax水平，然后计算BCL-2/Bax。

1.3观察指标 (1)HSCT后随访1年评价疗效，包括中性粒细胞植活时间、血小板植活时间及并发症发生率。(2)不同疗效患者外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax水平。(3)分析外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax水平与中性粒细胞植活时间、血小板植活时间的相关性。(4)比较不同类型患者的中性粒细胞植活时间、血小板植活时间。(5)采用多元线性回归分析中性粒细胞植活时间、血小板植活时间的影响因素，并建立回归方程。

2 结 果

2.1HSCT治疗效果分析 56例SAA患者经HSCT治疗，中性粒细胞植活时间8～23 d，平均(15.38±3.76)d；血小板植活时间7～173 d，平均(89.65±22.64)d。27例患者HSCT治疗后1年内出现移植物抗宿主病，发生率48.21%，其中Ⅰ度14例(51.85%)，Ⅱ度9例(33.33%)，Ⅲ度4例(14.81%)。感染16例，发生率28.57%，出血9例，发生率16.07%。无病死病例。以中性粒细胞植活时间、血小板植活时间均值为界，高于均值的患者移植物抗宿主病、感染并发症发生率更低(P<0.05)。见表1。

表1 HSCT治疗效果分析

2.2不同HSCT治疗效果的患者外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax水平比较 56例SAA患者经检测发现，外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6的表达量为(58.02±11.87)%，BCL-2水平为(0.42±0.10)μg/L，Bax水平为(0.37±0.08)μg/L，BCL-2/Bax为1.14±0.28。中性粒细胞植活时间、血小板植活时间高于均值的患者外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6的表达量和血清BCL-2水平、BCL-2/Bax较低，Bax水平较高(P<0.05)。见表2。

表2 不同HSCT治疗效果患者外周血CD8+ T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax水平比较

2.3外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax水平与中性粒细胞植活时间、血小板植活时间相关性 外周血CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量与中性粒细胞植活时间、血小板植活时间呈负相关(r=-0.803、-0.707，均P<0.001)；BCL-2/Bax与中性粒细胞植活时间、血小板植活时间呈负相关(r=-0.802、-0.680，均P<0.001)，见图1～4。

图1 SLAMF6与中性粒细胞植活时间的关系

图2 BCL-2/Bax与中性粒细胞植活时间的关系

2.4不同类型患者中性粒细胞植活时间、血小板植活时间比较 有主要脏器功能不全、移植物抗宿主病及CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax水平较高者中性粒细胞植活时间、血小板植活时间更长(P<0.05)。见表3。

表3 不同类型患者的中性粒细胞植活时间、血小板植活时间比较

2.5多元线性回归分析 经多元线性回归分析，筛选出与中性粒细胞植活时间、血小板植活时间有线性关系的因素：CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax对应的线性系数差异有统计学意义(P<0.05)。建立中性粒细胞植活时间回归模型：中性粒细胞植活时间=35.807-0.325×SLAMF6-1.255×BCL-2/Bax，回归模型具有统计学意义(F=102.31，P<0.001)，自变量可解释中性粒细胞植活时间89.2%(R2=0.894，调整R2=0.892)的变异量。建立血小板植活时间回归模型：血小板植活时间=67.220-2.999×SLAMF6-19.704×BCL-2/Bax，回归模型具有统计学意义(F=185.04，P<0.001)，自变量可解释血小板植活时间92.5%(R2=0.927，调整R2=0.925)的变异量。见表4、图5～6。

图3 SLAMF6与血小板植活时间的关系

图4 BCL-2/Bax与血小板植活时间的关系

续表3 不同类型患者的中性粒细胞植活时间、血小板植活时间比较

表4 多元线性回归分析

图5 中性粒细胞植活时间实际值与预测值

3 讨 论

HSCT是当前重建SAA患者骨髓造血功能，确保患者能长期生存的主要手段。尽管HSCT前已有标准预处理方案，但不同SAA患者HSCT效果不尽相同，如中性粒细胞及血小板植活时间存在差异[11]。本研究也发现，HSCT治疗效果不尽相同，尤其是血小板植活时间最长近6个月，而中性粒细胞及血小板植活时间越短的患者并发症发生率越低，患者获益更大。此与近年研究结论一致[12]。因此，有效评估SAA患者HSCT治疗的时效性对指导临床积极完善干预策略至关重要。

目前SAA致病机制尚未完全明确。多数报道表明，此疾病的发生、发展可能与自身免疫所致造血干细胞损伤有关[13-14]。同时机体移植排斥反应也是HSCT能否成功的主要决定因素[15]。由此可见，机体免疫相关调控机制或与HSCT后中性粒细胞植活时间、血小板植活时间有关。SLAMF6是表达在淋巴细胞表面的一种跨膜糖蛋白受体，对淋巴细胞分化、功能具有调节作用，其参与系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发病过程[16]。有研究通过基因敲除技术证实，SLAMF6-/-小鼠Th1类细胞因子增加，而Th1类细胞因子缺失，并得出SLAMF6可能在机体免疫中发挥负调控作用[17-18]。本研究发现，中性粒细胞及血小板植活时间较长患者外周血SLAMF6呈低表达状态。据此推测，SLAMF6低表达可能会造成机体免疫过度而影响中性粒细胞及血小板顺利植入。分析原因，主要是造血干细胞作为移植物进入机体后可激发机体免疫排斥反应，而SLAMF6低表达可直接造成Th1/Th2平衡偏移，并引起Th1细胞过度增殖及生成、释放白细胞介素-2、γ干扰素等多种细胞因子，加重造血干细胞免疫损伤。另外，研究显示，初治SAA患者外周血CD8+T淋巴细胞表面SLAMF6低表达，而CD8+T淋巴细胞及其效应因子水平显著升高[19]。据此认为，SLAMF6低表达可能会造成“杀手”CD8+T淋巴细胞过度激活而增加中性粒细胞及血小板植活难度。相关性分析发现，SLAMF6表达与中性粒细胞及血小板植活时间呈负相关，且是二者植活时间的独立因素，说明SLAMF6或可作为临床评估HSCT疗效的客观依据。

BCL-2/Bax决定细胞“命运”。研究显示，BCL-2/Bax水平升高预示细胞生命延长，否则细胞凋亡加速[20]。廖亮英等[21]研究显示，可通过调节BCL-2、Bax表达而促进神经干细胞移植大鼠神经功能恢复。本研究发现，BCL-2/Bax值低时，SAA患者中性粒细胞及血小板植活时间延长，提示BCL-2/Bax值可能与HSCT疗效有关。但有研究指出，中性粒细胞及血小板植活情况是多因素作用的结果，如移植前巨细胞病毒血症、营养状态均是其影响因素[22-23]。本研究也发现，移植物抗宿主病与HSCT疗效有关，但校正混杂因素后，仅SLAMF6、BCL-2/Bax进入方程，提示SLAMF6、BCL-2/Bax是HSCT疗效的独立因素。分析可能的原因：(1)BCL-2能抑制细胞程序性凋亡，参与细胞线粒体、核孔复合体信号传递，且能通过改变线粒体外膜通透性而调节促细胞凋亡因子的释放，而Bax作为BCL-2蛋白家族主要成员之一，是一种促细胞凋亡蛋白。因此，BCL-2/Bax值降低时可能会造成新植入造血干细胞增殖、分化受影响，以致中性粒细胞及血小板植活时间延长。(2)研究证实，SAA患者血超氧化物歧化酶、过氧化氢酶水平呈异常状态，氧化应激参与此疾病发生发展过程[24]。BCL-2是一种重要抗氧化剂，可调节机体内环境氧化还原状态，减轻或阻断细胞及其组分被氧化损伤，而BCL-2低水平状态或直接造成造血干细胞受氧化应激诱导而衰老。上述研究表明，BCL-2/Bax水平与HSCT疗效关系密切。后续分析发现，CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax水平可解释中性粒细胞植活时间及血小板植活时间的变异量均达89%以上，说明SLAMF6、BCL-2/Bax可为临床评估HSCT疗效提供客观依据。但HSCT治疗后病情转归复杂，除与患者原生免疫系统有关外，还与供者干细胞分化及增殖而来的中性粒细胞有关，当其将自身组织作为“异物”产生免疫排斥时亦会影响HSCT整体效果，而患者CD8+T淋巴细胞SLAMF6表达量、BCL-2/Bax水平是否与此免疫反应强度有关仍需继续探讨。

综上可知，SAA患者SLAMF6与BCL-2/Bax表达下调会延长HSCT治疗后中性粒细胞植活时间、血小板植活时间，二者可作为预测HSCT疗效的指标。