原发性干燥综合征患者唾液腺中染色质调节因子相关基因的表达分析及其与免疫浸润的关系*

张乃丹，刘利洪，孙家祥，袁成良

德阳市人民医院检验科，四川德阳 618000

干燥综合征(SS)也称为自身免疫性外分泌疾病，口干和眼干是SS的主要临床表现。根据病因是否明确通常将该病分为原发性和继发性。原发性干燥综合征(pSS)是一种发病率较高的自身免疫性疾病，由于起病隐匿，在早期诊断方面存在困难。目前临床治疗主要以替代治疗和缓解症状为主。关于pSS的发病机制目前尚不清楚，其中遗传背景和免疫因素被认为是pSS发生和发展的重要基础[1-2]。表观遗传学是研究基因表达可遗传变化的一门学科，其特点为DNA序列不发生变化。表观遗传学机制通过调节基因表达在pSS的发病中发挥重要作用[3]。染色质调节因子(CRs)是表观遗传学中不可或缺的上游调控因子，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑3大类。已有研究提示，基因突变可以干扰CRs的功能，CRs功能失调会进一步导致染色质结构异常并出现与致病相关的表观遗传学改变，最终导致疾病预后不佳[4]。随着对免疫病理机制的深入研究，免疫浸润及细胞异质性在pSS中的研究越来越受到学者的关注。为了进一步研究CRs与pSS免疫浸润特征的关系，本课题组尝试从差异表达基因(DEGs)和免疫浸润的角度进行研究，可能有助于发现预测和诊断pSS的潜在生物标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料 从GEO数据库下载了3个包含pSS患者和健康对照者唾液腺基因表达阵列的数据集，分别是GSE7451、GSE23117和GSE40611。其中GSE7451包含10例pSS患者和10例健康对照者唾液腺样本；GSE23117包含11例pSS患者和4例健康对照者唾液腺样本；GSE40611包含17例pSS患者、14例非pSS患者和18例健康对照者唾液腺样本。本研究最终纳入38例pSS患者作为pSS组，32例健康对照者作为对照组，14例非pSS患者被排除。

1.2方法

1.2.1筛选DEGs 对所有纳入研究的基因表达阵列采用R语言(版本号4.0.3)进行预处理，包括数据合并、归一化和log2对数转换，最终得到22 189个基因的表达情况。当多个探针对应同一基因时，取其平均值作为表达值。本研究采用代理变量分析(SVA)程序包消除批量效应。通过查阅已有文献，共收集了870个CRs相关基因的信息，并将P<0.05和|log2FC|>0.50设为筛选DEGs的条件，FC为倍数改变。采用LIMMA程序包筛选CRs相关的DEGs[5]。

1.2.2基因本体论(GO)对DEGs的富集分析 本研究使用enrichment plot程序包对DEGs进行GO富集分析。GO富集分析将分别从生物学过程、细胞组分和分子功能3方面进行分析。使用barplot程序包绘制条形图。对于差异有统计学意义的数据，展示前4条分析结果；对于差异不具有统计学意义的结果不进行展示。

1.2.3免疫细胞和免疫功能的相关性分析 为了评估pSS患者唾液腺免疫微环境的变化情况，采用基因集变异分析(GSVA)计算出上述3个唾液腺基因表达阵列中共22 189个基因的变异分数。通过GSEA官网下载并整理了与16种免疫细胞与13种免疫功能相关的基因集。采用ssGSEA算法分析上述2个数据集并取交集，计算免疫浸润评分，比较对照组与pSS组免疫细胞和免疫功能的评分差异。采用corrplot程序包分别分析16种免疫细胞与13种免疫功能的相关性并绘制相关性热图。采用相关系数来评价免疫细胞与免疫功能的相关性，分为极强相关、强相关、中等相关、弱相关和极弱相关。16种免疫细胞包括树突状细胞(DCs)、活化的树突状细胞(aDCs)、未成熟树突状细胞(iDCs)、浆细胞样树突状细胞(pDCs)、B细胞、T辅助细胞、细胞毒性(CD8+)T细胞、滤泡辅助性T细胞(Tfh)、1型辅助性T细胞(Th1)、2型辅助性T细胞(Th2)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞(Treg)、NK细胞、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞。13种免疫功能包括抗原提呈细胞(APC)共抑制、APC共刺激、CC趋化因子受体(CCR)、免疫检查点、细胞杀伤活性、T细胞共抑制和共刺激、人白细胞抗原(HLA)、主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHC Ⅰ类)、炎症反应、副炎症反应、Ⅰ型和Ⅱ型干扰素反应。

2 结 果

2.1DEGs筛选 本研究共筛选出11个与CRs相关的DEGs，其中10个基因上调，1个基因下调。上调居前5位的DEGs分别是干扰素诱导的四肽重复序列蛋白3、载脂蛋白B MRNA编辑酶催化亚基3G(APOBEC3G)、SP110、E2泛素结合酶家族D1(UBE2D1)和SMCHD1，下调基因为EYA3，差异表达的火山图见图1。

注：绿色表示显著下调(P<0.05)，黑色代表差异无统计学意义(P<0.05)，红色表示显著上调(P<0.05)。

2.2GO富集分析在DEGs中的应用 对筛选出的11个DEGs进行GO分析，找出DEGs频率最高的4种生物学过程，包括正向调控DNA修复、调节DNA损伤刺激反应、非同源端连接修复双链DNA和DNA修复。细胞组分功能富集前4位依次为性染色体、PML核体、染色体端粒和核心蛋白复合体。分子功能由于未富集到DEGs，暂无数据展示。

2.3免疫浸润评分及相关性分析 本研究采用ssGSEA算法，共获得了16种免疫细胞和13种免疫功能的免疫浸润评分。在16种免疫细胞中，免疫浸润评分相关性排前5位的组合分别为TIL和B细胞(r=0.90,P<0.001)、Tfh和TIL(r=0.72,P<0.001)、B细胞和Tfh(r=0.70,P<0.001)、pDCs和TIL(r=0.69,P<0.001)、Treg和TIL(r=0.68,P<0.001)。在13种免疫功能中，免疫浸润评分相关性排前5位的组合分别为免疫检查点和T细胞共刺激(r=0.92,P<0.001)、免疫检查点和CCR(r=0.89,P<0.001)、免疫检查点和T细胞共抑制(r=0.88,P<0.001)、CCR和T细胞共刺激(r=0.86,P<0.001)、CCR和T细胞共抑制(r=0.82,P<0.001)。见图2。

注：A为免疫细胞的相关性分析；B为免疫功能的相关性分析；方格内数字代表相关系数，红色代表正相关，蓝色代表负相关。

2.4对照组与pSS组的免疫浸润评分比较 对pSS组和对照组分别进行了免疫细胞和免疫功能的免疫浸润评分差异分析。16种免疫细胞中，9种免疫细胞的免疫浸润评分(pSS组vs.对照组)显著上调(P<0.05)，分别为aDCs、中性粒细胞、pDCs、TIL、Treg、B细胞、巨噬细胞、辅助性T细胞和Th2细胞。在13种免疫功能中，8种免疫功能显著上调(P<0.05)，分别为HLA、炎症反应、MHCⅠ类分子、副炎症反应、Ⅰ型干扰素反应、APC共抑制、CD8+T细胞杀伤活性和T细胞共抑制。见图3。

注：A为免疫细胞的免疫浸润评分；B为免疫功能的免疫浸润评分；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns表示差异无统计学意义。

3 讨 论

pSS是一种以特异性病理损害为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病。早期对pSS相关的DEGs研究主要集中在与信号通路的相关性分析、蛋白相互作用网络等方面[5-7]。从DEGs中筛选CRs相关基因并从免疫浸润的角度来进行的研究比较少见。本研究结果显示，在pSS患者唾液腺中，与CRs相关的DEGs以表达上调为主，表达下调的DEGs较少。干扰素诱导的四肽重复序列蛋白3(IFIT3)是一种蛋白编码基因，在干扰素信号转导方面具有重要的作用。高表达IFIT3通过线粒体抗病毒信号途径(MAVS)和干扰素基因刺激物途径(STING)介导TANK结合激酶1(TBK1)活化，促进干扰素调节因子3(IRF3)从胞浆转位到细胞核，导致Ⅰ型IFN的产生[8]。Ⅰ型IFN与其受体结合，介导信号转导和转录激活因子1(STAT1)磷酸化，促进干扰素诱导基因(ISGs)的表达[9]。已有研究通过靶向TBK1抑制剂治疗pSS后发现，Ⅰ型IFN阳性患者外周血单个核细胞(PBMCs)表达的IFIT3较阴性患者显著降低[10]。上述研究提示，IFIT3在Ⅰ型IFN信号通路调节中具有重要作用。本研究结果提示，与健康对照者相比，pSS患者Ⅰ型干扰素反应免疫浸润评分显著升高，提示IFIT3基因可能在pSS患者唾液腺损害中具有一定的作用。

APOBEC3G属于APOBEC3家族，具有催化RNA和单链DNA的位点特异性脱氨基的作用。APOBEC3通过基因突变，导致DNA损伤和细胞周期停滞，在IFN刺激下，APOBEC3相关蛋白在单核细胞和巨噬细胞中大量表达，出现高水平的循环DNA，加速炎症反应的发生[11]。本研究通过对pSS患者唾液腺免疫浸润的研究发现，巨噬细胞在pSS患者中显著升高，同时炎症反应也显著高于健康对照者，这与已有研究结果一致。SP110基因是SP110核蛋白的编码基因，SP110核蛋白可作为基因转录的激活剂，在核糖体产生和诱导骨髓细胞分化中发挥了重要作用[12]。UBE2D1通过与E1泛素激活酶和E3泛素蛋白连接酶相互作用，参与调节细胞因子的产生。已有研究提示，UBE2D1与pSS患者抗Ro52抗体的E3泛素蛋白连接酶活性有关[13]。目前暂无关于SMCHD1基因在pSS中的相关研究，由于本研究纳入的样本量偏少，关于CRs相关基因在pSS中的筛选还需要纳入更多样本，进行多中心的验证。

关于免疫微环境在pSS发生发展中的研究越来越受到学者重视。本研究采用ssGSEA算法将免疫细胞浸润评分扩展到16种常见的免疫细胞，并增加了13种免疫功能分析。结果显示，在pSS患者中存在免疫微环境的异常活化，并且异常活化的多种免疫细胞和免疫功能评分均显著高于健康对照者(P<0.05)。这些免疫浸润模式可能为pSS免疫治疗提供重要线索。首先，本课题组研究了这些具有显著性差异的免疫细胞之间以及免疫功能之间是否具有一定的相关性，这是一个创新的尝试，以便更全面了解pSS患者免疫微环境的特点。在16种免疫细胞中，相关性较强的为TIL和B细胞，其次为Tfh和TIL。TIL主要由CD8+T淋巴细胞和三级淋巴结构(TLS)的B细胞组成，并能够产生Tfh细胞。功能实验提示活化的Tfh是激活TLS内免疫球蛋白和IFN-γ产生的重要因素[14]。Tfh在维持B细胞生存和分化过程中具有重要作用，在高度局灶性淋巴细胞性唾液腺炎的pSS患者中，循环Tfh细胞的CCR7loPD-1hi亚群增加，并与ESSDAI疾病活动度评分和活化的B细胞显著相关[15]。而在13种常见的免疫功能中，相关性较强的为免疫检查点和T细胞共刺激、免疫检查点和CCR。已有研究提示，通过对骨肉瘤患者相关免疫功能，包括APC共抑制、CCR、免疫检查点与T细胞共刺激等进行评分，有助于预测患者对放疗的反应性和总体存活率[16]。目前关于免疫功能评分在pSS患者治疗监测和预后中的研究较少，因此本课题组也进一步比较了pSS患者与对照组免疫浸润评分的差异。本研究发现pSS患者有多种免疫细胞，包括aDCs、巨噬细胞、Treg、CD8+T细胞、中性粒细胞、B细胞、Tfh和TIL，以及多种免疫功能，包括MHC Ⅰ类、HLA、Ⅰ型IFN反应、副炎症反应等显著高于健康对照者。已有研究发现，在pSS患者中，记忆B细胞、Tregs和aDCs的比例显着升高，并可能在疾病的发生发展中具有重要作用[17]。另有研究发现，pSS患者唾液中干扰诱导蛋白10(IP-10)和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)显著升高，并与临床口腔表现的严重程度有关，提示巨噬细胞和先天免疫在pSS发病机制中具有重要作用[18]。对CD8+T细胞的研究提示，pSS模型中浸润性CD8+T细胞明显多于CD4+T细胞，减少CD8+T细胞的浸润可有效减少对唾液腺的破坏[19]。此外，通过对pSS患者唾液腺中Tfh亚群进行分析，发现Tfh1、Tfh2和Tfh17细胞在pSS患者唾液腺样本中百分比较高，抗Ro/SSA抗体与Tfh17亚群呈正相关，并且(Tfh2+Tfh17)/Tfh显著高于系统性红斑狼疮，提示pSS与系统性红斑狼疮具有差异性的Tfh谱[20]。而本研究发现的异常活化的免疫功能与以往文献报道不尽一致[17-20]。一项使用微阵列分析唾液腺中基因表达的研究发现，pSS患者基因表达模式涉及多种慢性炎症通路，包括趋化因子、细胞因子、MHC和IFN[21]。与以往研究不同的是，本研究还发现免疫功能中的副炎症反应的免疫浸润评分显著上调。在肿瘤细胞系中，副炎症反应具有某些正常巨噬细胞的功能，它可以根据肿瘤的需要模拟不同的免疫亚群。此外，本研究中巨噬细胞的免疫浸润评分也显著上调，提示未来对副炎症反应的研究也可能为pSS的治疗提供重要线索。

本研究存在一定的局限性。因为本课题组主要关注的是目前文献已经报道过的CRs相关基因在pSS中与免疫浸润的关系，可能忽略了目前文献尚未报道的基因。其次，本研究纳入的样本量较少，对免疫浸润评分未进一步进行验证，在今后的研究中，还将对上述CRs相关基因进行功能实验，以明确CRs在pSS致病过程中的作用。

综上所述，CRs相关基因虽然在pSS患者唾液腺中的DEGs数量较少，但是与受损唾液腺的免疫浸润异常有关，值得临床医生的关注。